骨橋蛋白和CD44v6在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

張晉弘，許彥枝，張玲玲，劉月平，劉 健*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，河北石家莊050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北石家莊050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊050011）

·論 著·

骨橋蛋白和CD44v6在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

張晉弘1，許彥枝2，張玲玲3，劉月平3，劉 健2*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，河北石家莊050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北石家莊050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊050011）

目的 探討骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和黏附分子CD44拼構(gòu)變異體6（homing cell adhesion molecule variant6，CD44v6）在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法檢測(cè)OPN和CD44v6蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理學(xué)資料之間的關(guān)系。結(jié)果OPN和CD44v6在口腔鱗狀細(xì)胞癌中陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.3％、61.2％，均明顯高于在癌旁正?？谇火つぶ械谋磉_(dá)（P＜0.01）。OPN和CD44v6組織分化Ⅲ級(jí)的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與性別、年齡無(wú)關(guān)。結(jié)論OPN和CD44v6與口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在其進(jìn)展過(guò)程中起著重要的作用；而OPN與CD44v6的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

口腔腫瘤；骨橋蛋白質(zhì)；免疫組織化學(xué)

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部惡性腫瘤中最常見(jiàn)病理學(xué)類(lèi)型，5年生存率約為50％，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素，因而早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是改善患者預(yù)后的重要因素。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，首先發(fā)現(xiàn)于骨基質(zhì)中。近年來(lái)，OPN與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益受到關(guān)注。OPN通過(guò)特有的與細(xì)胞黏附相關(guān)的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列與其受體整合素、CD44等結(jié)合來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的趨化、黏附、遷移和增殖，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［1］。目前研究［2］顯示，細(xì)胞黏附分子CD44的表達(dá)與人類(lèi)多種癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中其變體CD44v6與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)OSCC中OPN及CD44v6蛋白的表達(dá)情況，探討其與病理特征之間的關(guān)系，旨在為判斷預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療及預(yù)防患者復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2005年1月—2010年12月手術(shù)切除的原發(fā)性O(shè)SCC中性福爾馬林固定石蠟包埋組織98例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療。其中男性51例，女性47例，年齡34～76歲，平均59.18歲；組織分化Ⅰ～Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)74例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，無(wú)轉(zhuǎn)移41例。選取30例癌旁組織（證實(shí)2cm外無(wú)腫瘤）及非腫瘤患者的正常組織。蠟塊4μm連續(xù)切片，其中一張切片常規(guī)HE染色，其余切片用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)：主要試劑包括OPN單克隆抗體（鼠抗人，AKm2A1）為美國(guó)Santa Cruz公司開(kāi)發(fā)產(chǎn)品；CD44v6單克隆抗體（鼠抗人，VEF-7）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用SP免疫組織化學(xué)染色法常規(guī)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)4μm厚切片。經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化，高壓煮沸修復(fù)抗原；滴加一抗，置于4℃冰箱過(guò)夜；依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG及試劑，DAB顯色；蘇木素復(fù)染后水洗，依次酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，最后顯微鏡下觀察。分別用1.5％正常兔血清和0.01mol/L PBS液取代第一抗體作為替代對(duì)照和空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定：陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為，光鏡下觀察、綜合分析整張切片陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例和染色強(qiáng)度。OPN蛋白的陽(yáng)性定位在胞漿，陽(yáng)性表現(xiàn)為瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的、定位準(zhǔn)確的淡黃色至棕黃色顆粒。CD44v6的陽(yáng)性定位在胞膜，陽(yáng)性表現(xiàn)為瘤細(xì)胞胞膜出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的、定位準(zhǔn)確的淡黃色至棕黃色顆粒。

以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的得分之和進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，無(wú)染色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比為陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率≤5％記0分，＞5％～25％記1分，＞25％～50％記2分，＞50％記3分。將上述2項(xiàng)積分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為中等強(qiáng)度陽(yáng)性（++），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。按照OPN及CD44v6蛋白表達(dá)程度為陽(yáng)性組（++～+++）和陰性組（-～+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD44v6和OPN在OSCC及正常組織中的表達(dá)：98例OSCC中OPN的陽(yáng)性率為64.3％，顯著高于在癌旁及正常組織中表達(dá)的16.7％，CD44v6的陽(yáng)性率為61.2％，顯著高于在癌旁及正常組織中的表達(dá)10.0％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1，圖1～3。

2.2 CD44v6和OPN表達(dá)與臨床病理學(xué)資料的關(guān)系：CD44v6和OPN在組織分化Ⅲ級(jí)的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與性別、年齡無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

表1 CD44v6、OPN在OSCC及正常組織中的表達(dá)Table1 CD44v6 and OPN expression in OSCC and pericancerous tissues （n）

表2 CD44v6、OPN在OSCC中的表達(dá)及其與臨床病理資料的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of CD44v6，OPN and the clinicopathological factors in OSCC （n）

3 討 論

人類(lèi)OPN基因位于染色體4 q21～q25，包括7個(gè)外顯子和314個(gè)氨基酸殘基，其中含有如鈣結(jié)合域、凝血酶裂解位點(diǎn)及整合素RGD結(jié)合序列等多個(gè)功能結(jié)合區(qū)，在細(xì)胞的黏附與遷移、組織修復(fù)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用［3］。最初的研究主要集中在骨骼和腎臟疾病中。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)OPN與腫瘤的關(guān)系很密切，在結(jié)腸癌［4］、卵巢癌［5］及頭頸部腫瘤［6］等原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤組織中高表達(dá)，并且在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)血清和組織OPN高表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率呈增高趨勢(shì)，表明OPN可能在腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用［7］。

CD44是通過(guò)細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白介導(dǎo)細(xì)胞黏附作用，其中含有外顯因子v6的CD44變異體（CD44v6）與腫瘤的關(guān)系較密切［8］，且有學(xué)者認(rèn)為其陽(yáng)性表達(dá)率與OSCC轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)關(guān)系［9］。

本研究結(jié)果顯示，組織分化越差OPN及CD44v6表達(dá)越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率也明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。提示OPN及CD44v6可能參與OSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Duterme等［10］認(rèn)為在許多細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞外膜，胞內(nèi)OPN與CD44、ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白形成復(fù)合體。Rao等［11］研究顯示OPN和CD44v6表達(dá)呈一致性，這與本研究結(jié)果相似，CD44v6表達(dá)可能隨OPN表達(dá)增加而上調(diào)。推測(cè)OPN可能通過(guò)與受體CD44v6結(jié)合來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的趨化、黏附和遷移而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷徙轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。因此，臨床上有望通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)OPN和CD44v6表達(dá)預(yù)測(cè)OSCC患者的預(yù)后，為OSCC患者的預(yù)后判斷和臨床治療提供理論依據(jù)。（本文圖見(jiàn)封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF OSTEOPONTIN AND CD44v6 IN ORAL SQUAMOUSCELL CARCINOMA

ZHANG Jinhong1，XU Yanzhi2，ZHANG Lingling3，LIU Yueping3，LIU Jian2*（1.Department of Stomatology，the First Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China；2.Department of Stomatology，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China；3.Department of
Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China）

Objective To investigate the expression of osteopontin（OPN）and CD44v6 and their relationship with clinical pathological characteristics in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe expression of OPN and CD44v6 proteins in oral squamous cell carcinoma were detected by SP immunohistochemical method.According to the clinical information，all data were analyzed by SPSS13.0 for windows to explore the relationship between the two indexes and the pathological features.ResultsThe positive rates of OPN and CD44v6 in oral squamous cell carcinoma were respectively 64.3％and 61.2％，which were significantly higher compared with those of adjacent non-tumor tissues and normal oralmembrane tissues（P＜0.01）.The positive rate expression of OPN and CD44v6 of poor differentiation group were significantly higher than those of well differentiation group and moderation differentiation group（P＜0.05）.The metastasis of lymph node，the expression levels of OPN and CD44v6 in lymph nodemetastasis group were significantly higher than those of non lymph nodemetastasis group（P＜0.05），however，no significant difference existed in gender and age.ConclusionThe

mouth neoplasms；osteopontin；immunohistochemistry

R739.8

A

1007-3205（2013）07-0745-04

2013-04-01；

2013-05-08

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目（20100281）

張晉弘（1975-），男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔頜面外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：zjh888fff@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.001

expression of OPN and CD44v6 are closely related with the differentiation degree，lymphatic node metastasis of oral squamous cell carcinoma，and they play important roles in the development of oral squamous cell carcinoma，and the relationship between OPN and CD44v6 gen needs further studies.