病毒載體介導(dǎo)的椎間盤退變生物治療的最新進(jìn)展

趙哲夫，吳小濤，王運(yùn)濤

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院骨科，江蘇南京 210009)

下腰痛(low back pain，LBP)已經(jīng)成為嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的主要原因之一。它不僅使許多人喪失了勞動(dòng)能力，而且給許多國(guó)家?guī)砹司薮蟮尼t(yī)療負(fù)擔(dān)，在美國(guó)，平均每名下腰痛患者一年所需要的治療費(fèi)用約為13 015 美元[1]?，F(xiàn)今的研究[2-3]已表明，下腰痛的成因與腰椎間盤退變是息息相關(guān)的。目前針對(duì)椎間盤退變(intervertebral disk degeneration，IDD)的治療手段以保守治療及手術(shù)治療為主，但這些方法在緩解臨床癥狀的同時(shí)，無法從根本上阻止椎間盤的生物學(xué)退變，甚至?xí)斐舌徑倒?jié)段加速退變的后果。隨著近些年在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)τ谧甸g盤退變相關(guān)的病理生理過程的研究越來越深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始尋求一種生物學(xué)治療方法去延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。作者就目前病毒載體介導(dǎo)的椎間盤生物治療研究現(xiàn)狀及進(jìn)展作一綜述。

1 椎間盤的生物學(xué)特性及退變機(jī)制

椎間盤在形態(tài)學(xué)上由髓核、纖維環(huán)、上下軟骨終板三部分構(gòu)成，主要成分為水分、膠原蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。中央的髓核是富含大量蛋白多糖的膠凍樣基質(zhì)，它不僅含有大量水分，而且利用滲透壓梯度將椎間盤外周的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散到髓核中心的細(xì)胞。髓核外周包圍的同心圓排列的纖維環(huán)是由濃密的纖維組織構(gòu)成，富含膠原成分，內(nèi)層纖維環(huán)以抗壓力的Ⅱ型膠原為主，外層纖維環(huán)以抗張力的Ⅰ型膠原為主。在椎間盤承受壓力時(shí)發(fā)揮重要的生物力學(xué)作用。軟骨終板位于椎體上下表面與椎間盤髓核、纖維環(huán)之間，在生物力學(xué)、椎間盤營(yíng)養(yǎng)等方面亦發(fā)揮不可或缺的作用。

退變的椎間盤最普遍的特點(diǎn)在于打破了椎間盤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)與日益加劇的退變進(jìn)程之間的平衡[4]。隨著這種失平衡的進(jìn)展，退變椎間盤逐漸出現(xiàn)了生物學(xué)方面的改變，如纖維環(huán)與髓核部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞密度增加的同時(shí)活性下降[5]、椎間盤細(xì)胞衰老[6-7]、凋亡加劇[5]，以及分解代謝中所涉及的基質(zhì)金屬蛋白酶與聚蛋白多糖酶等活性上升、細(xì)胞因子表達(dá)增加[5-8]。這些改變都導(dǎo)致了髓核區(qū)域的蛋白多糖和水分進(jìn)一步丟失，取而代之的是增生的纖維組織、剝脫的纖維環(huán)、狹窄的椎體間隙和椎間盤生物力學(xué)作用的喪失[9]。雖然椎間盤退變的機(jī)制至今仍未完全清楚，但退變過程中涉及的多種基因及生物力學(xué)因素已逐漸清晰，再結(jié)合椎間盤的組織特性:(1)全身最大無血管組織;(2)上下終板與纖維環(huán)組成的密閉框架，于是病毒載體介導(dǎo)的椎間盤退變生物治療應(yīng)運(yùn)而生。

2 病毒載體的選擇

為了使目的基因在特定的靶細(xì)胞上高效地表達(dá)，載體的選擇顯得尤為重要。載體可分為非病毒載體和病毒載體，前者的優(yōu)點(diǎn)是無免疫原性、無致病性、制備簡(jiǎn)單以及攜帶外源基因的容量較大，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、目的基因瞬時(shí)表達(dá)及靶向性限制了其臨床應(yīng)用[10]。病毒載體雖然存在細(xì)胞毒作用、免疫原性等安全問題，但通過病毒重組技術(shù)可以去除病毒的致病基因，保留其復(fù)制與感染能力。這樣其高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)率、目的基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)得以突顯，也使其在椎間盤退變基因與細(xì)胞治療中得到了廣泛的應(yīng)用。病毒載體又可分為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等可整合入宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄型和游離在宿主體內(nèi)以腺病毒、腺相關(guān)病毒為代表的質(zhì)粒型，后者對(duì)有絲分裂不活躍的椎間盤細(xì)胞有高效的轉(zhuǎn)染率，所以腺病毒及腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)成為了目前椎間盤退變生物治療中最熱門的病毒載體。與腺病毒相比，腺相關(guān)病毒的優(yōu)點(diǎn)在于:(1)感染率高，免疫原性、細(xì)胞毒性較弱[11];(2)宿主范圍廣[11-12];(3)攜帶的外源基因能長(zhǎng)期表達(dá)并可調(diào)控。因此，腺相關(guān)病毒成為了目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣、相對(duì)最安全的病毒載體。

3 病毒載體介導(dǎo)的椎間盤退變基因治療

從1997年Wehling等首先提出椎間盤退變基因治療以來，全世界許多學(xué)者對(duì)這項(xiàng)治療產(chǎn)生了濃厚興趣。目前運(yùn)用病毒載體將有治療潛力的外源性基因，如生長(zhǎng)分化因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)等基因?qū)氚屑?xì)胞可促進(jìn)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成、抑制分解代謝，起到逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的作用。Wang等[13]利用重組腺相關(guān)2型病毒(recombinant adeno-associated virus-2，rAAV2)作為載體，成功將人BMP-7基因轉(zhuǎn)染至犬的髓核細(xì)胞，并在第4、7、14天對(duì)髓核細(xì)胞分泌的蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原進(jìn)行定量分析，證實(shí)了BMP-7的表達(dá)明顯提高了蛋白多糖和Ⅱ型膠原的生成，而且沒有出現(xiàn)腺病毒載體所引起的強(qiáng)烈細(xì)胞免疫反應(yīng)。Leckie等[14]將帶有BMP-2和TIMP-1的AAV2注射到纖維環(huán)穿刺造成的新西蘭大白兔椎間盤退變模型中，在注射后第0、6、12周分別運(yùn)用MRI檢測(cè)椎間盤T2信號(hào)，12周時(shí)進(jìn)行椎間盤組織學(xué)分析，證實(shí)治療組較對(duì)照組椎間盤退變明顯延緩，治療組中Ⅱ型膠原的血清標(biāo)志物端尾肽C迅速升高，效果持續(xù)到注射后12周。劉海飛等[15]用rAVV2型病毒作為載體，將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染至兔退變椎間盤髓核中，分別于4、8、12周獲取髓核細(xì)胞檢測(cè)蛋白多糖變化情況，證實(shí)rAVV2型病毒可以高效持久地使hTGF-β1在退變髓核細(xì)胞中表達(dá)，并明顯提高蛋白多糖水平。針對(duì)基因治療中存在的安全隱患，Sowa等[16]報(bào)道了一種利用AAV攜帶綠色熒光蛋白的基因治療控制系統(tǒng):AAV-RheoSwitch GFP，在體外實(shí)驗(yàn)中，在兔髓核細(xì)胞中大量注射AAV載體的控制系統(tǒng)，隨后增高對(duì)應(yīng)的活性配體濃度，最后移除配體。通過熒光檢測(cè)可以證實(shí)，利用配體來調(diào)控基因表達(dá)是可行的。在體內(nèi)試驗(yàn)中，增加綠色熒光蛋白的表達(dá)并沒有引起其他特異基因的高表達(dá)或在鄰近組織中表達(dá)。此系統(tǒng)有望大大提升椎間盤退變基因治療的安全性，為基因治療早日應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。

4 病毒載體介導(dǎo)的椎間盤退變干細(xì)胞治療

椎間盤生物治療領(lǐng)域另一熱點(diǎn)就是干細(xì)胞治療，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成為了研究的熱門。(1)來源廣泛，制備簡(jiǎn)單;(2)多向分化能力強(qiáng)，可誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞;(3)低表達(dá)MHC1，不表達(dá)MHC2，免疫原性低，不會(huì)引起宿主急性免疫反應(yīng)。然而在干細(xì)胞治療的初期，病毒載體介導(dǎo)的治療方式只是作為一種示蹤方法。通過基因標(biāo)記使干細(xì)胞在椎間盤區(qū)域的增殖、遷移、分化變得一目了然。Sakai等[17]報(bào)道使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染至兔自體BMSCs，再移植到兔退變椎間盤中，移植后48周可以通過熒光標(biāo)記更直觀地觀察BMSCs增殖與分化情況，證實(shí)了BMSCs移植是一種有效的治療方法。隨后國(guó)內(nèi)樊守剛[18]、Chen[19]、Miyamoto[20]均在各自的干細(xì)胞治療椎間盤退變的研究中運(yùn)用此項(xiàng)示蹤技術(shù)。隨著基因治療的發(fā)展，將TGF-β、BMPs、LMP-1、SOX9等一系列治療基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成了一種新的趨勢(shì)，其意義在于基因與干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用明顯提升了椎間盤修復(fù)能力。李華壯等[21]利用腺病毒載體在體外對(duì)BMSCs進(jìn)行hTGF-β1基因修飾，再移植到兔退變椎間盤中，12周后，X線結(jié)果顯示移植組椎間隙狹窄明顯抑制，免疫組化提示蛋白多糖、Ⅱ型膠原積聚較對(duì)照組明顯增多。許運(yùn)等[22]報(bào)道運(yùn)用慢病毒載體成功使SOX9基因修飾的BMSCs移植到兔退變椎間盤中，并穩(wěn)定表達(dá)治療基因。除了治療基因，也有學(xué)者利用腺病毒成功轉(zhuǎn)染CXCR4等干細(xì)胞定向遷移趨化的調(diào)控基因[23]，為進(jìn)一步調(diào)控干細(xì)胞的分化、遷移提供了思路。

5 病毒載體在椎間盤退變其他治療中的運(yùn)用

2009年日本學(xué)者 Suzuki等[24]首先將 RNA干擾技術(shù)運(yùn)用到椎間盤退變的治療中，由于此項(xiàng)技術(shù)可以特異性剔除和關(guān)閉特定基因表達(dá)。隨著椎間盤分解代謝、凋亡、衰老等涉及的基因逐漸明了，此項(xiàng)技術(shù)將成為一種有效的治療椎間盤退變的手段，而其中將可能采用腺病毒或慢病毒，利用病毒的高感染率、高表達(dá)特性，更好地展開RNA干擾椎間盤退變。此外，Zhang等[25]用慢病毒轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA沉默纖維環(huán)內(nèi)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)轉(zhuǎn)錄因子來延緩鼠椎間盤退變。

6 存在問題及展望

病毒載體介導(dǎo)的基因及干細(xì)胞治療為從根本上逆轉(zhuǎn)和控制椎間盤退變提供了希望，雖然相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)十分成功，但是要真正將這些技術(shù)應(yīng)用于臨床，仍然存在著以下幾點(diǎn)難題:

(1)目前使用的椎間盤退變模型以小動(dòng)物為主，力學(xué)環(huán)境大多與人體存在較大差異。雖然Lucas等[26]報(bào)道了激光造模能更好地模仿自然的椎間盤退變，但尚無控制動(dòng)物模型的退變程度的方法，這也為探索干細(xì)胞移植最佳治療窗口提出了難題。

(2)Serigno等[27]曾報(bào)道犬類椎間盤退變至少需要106干細(xì)胞才可達(dá)到治療效果。陳蕾等[28]報(bào)道BMSCs與髓核細(xì)胞無接觸共培養(yǎng)后，BMSCs分化為髓核樣細(xì)胞，在共培養(yǎng)15 d后，Ⅱ型膠原和蛋白多糖才保持穩(wěn)定水平。Wallach等[29]報(bào)道過高濃度的攜帶TGF-β1的腺病毒注射入兔椎間盤退變模型造成了雙側(cè)后肢末端的麻木。因此，尋找適宜的基因劑量、移植細(xì)胞數(shù)量及合適的治療時(shí)機(jī)發(fā)揮最佳的治療效果也是有待解決的問題之一。

(3)自2003年Sakai報(bào)道了動(dòng)物的干細(xì)胞療法以來，9 年中只有 Yoshikawa 等[30]、Orozco 等[31]、Haufe等[32]3例人體實(shí)驗(yàn)報(bào)道，而 Vadala等[33]報(bào)道泄漏的干細(xì)胞造成了兔椎間盤退變模型骨贅形成。Daniel等[34]報(bào)道將兔椎間盤外植體在 1 μg·ml－1的 BMP-2或TGF-β3中培養(yǎng)21 d，并沒有阻止椎間盤自然退變，但卻誘導(dǎo)了纖維環(huán)的骨化。同時(shí)，病毒載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄過程中存在促發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，以致于基因治療至今未有臨床試驗(yàn)報(bào)道。這一系列證據(jù)表明，明確治療的長(zhǎng)期副作用、提高安全性對(duì)于任何一項(xiàng)應(yīng)用于人體的治療都是格外關(guān)鍵的。

(4)為達(dá)到最佳的椎間盤修復(fù)效果，將組織工程學(xué)與多種生物學(xué)治療聯(lián)合運(yùn)用將是一個(gè)嶄新的治療思路。

(5)在基因治療調(diào)控中，應(yīng)用較多的是四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(“Tet-on”系統(tǒng))，但是否適合應(yīng)用于椎間盤退變治療?或者治療基因有無根據(jù)環(huán)境自我調(diào)控的可能?這些都為未來的病毒載體介導(dǎo)的基因治療提供了研究方向。而調(diào)控干細(xì)胞的遷移、分化也處在研究的初期[35]，探索更多有效的調(diào)控途徑將為安全高效的發(fā)揮治療作用提供積極保障。

相信隨著分子生物學(xué)的日益發(fā)展，病毒介導(dǎo)的椎間盤退變治療將會(huì)逐漸成熟并應(yīng)用于臨床，最終成為從根本上修復(fù)或延緩椎間盤退行性變的有效方法。

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