Tag SNPs在鑒定腫瘤易感性基因研究中的應(yīng)用

吳華彰，樊紅，2

(1.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院發(fā)育與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，江蘇 南京 210009)

腫瘤是一類(lèi)由遺傳與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，對(duì)腫瘤易感基因的研究一直是分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著全基因組連鎖分析方法［1］的應(yīng)用，很多單基因遺傳疾病的易感基因被鑒定出來(lái)，然而對(duì)腫瘤等多基因疾病的研究卻受到了極大的限制，于是人們開(kāi)始把注意力轉(zhuǎn)向以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)為分子標(biāo)記、以全基因組內(nèi)SNP和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies，GWAS)上［2］。因此，如何選擇候選 SNPs已成為關(guān)聯(lián)分析的關(guān)鍵。

由于SNP位點(diǎn)間存在LD現(xiàn)象，只需從SNPs位點(diǎn)集合中篩選出少量標(biāo)簽SNP(Tag SNPs)位點(diǎn)集合，就可以提供全體SNPs位點(diǎn)的遺傳模式信息。將Tag SNPs應(yīng)用于腫瘤等復(fù)雜性疾病的關(guān)聯(lián)分析，可以極大地減少遺傳分型的費(fèi)用，提高關(guān)聯(lián)分析的效率。如何有效地預(yù)測(cè)和利用Tag SNPs已經(jīng)是腫瘤易感性領(lǐng)域研究的關(guān)鍵所在。

1 候選Tag SNPs的獲取及分析

1.1 Tag SNPs與單體型

一條染色體上或某一染色體區(qū)域的一組關(guān)聯(lián)性SNPs位點(diǎn)被稱(chēng)作單體型(haplotype)。由于SNPs位點(diǎn)間存在著LD，所以只要用少數(shù)幾個(gè)SNPs即可特異性地鑒定出該連鎖群的單體型，這種SNP常被稱(chēng)為T(mén)ag SNP，又稱(chēng)單體型 Tag SNP(haplotype-tag SNP，ht SNP)。通過(guò)對(duì)單體型圖中大約50萬(wàn)個(gè)Tag SNP的掃描就可達(dá)到與全基因組掃描1 000萬(wàn)個(gè)SNP同樣的效果，使利用全基因組掃描尋找致病基因或疾病相關(guān)基因變得更為高效、全面和經(jīng)濟(jì)。

1.2 候選Tag SNPs的獲取方法

目前，關(guān)于Tag SNPs位點(diǎn)的獲取方法主要有3類(lèi)?；贚D選擇方法是根據(jù)SNP位點(diǎn)間LD的原理，選擇與其它SNP位點(diǎn)間具有較高LD值的SNP作為T(mén)ag SNP，將鄰近區(qū)域內(nèi)具有高LD值(r2≥0.8)的SNP位點(diǎn)組成一個(gè) LD簇，以 r2最大者為該單倍域(haplotype block)的 Tag SNP［3］。基于單體型域的選擇方法最早由Patil等［4］提出，是根據(jù)人類(lèi)單體型數(shù)量遠(yuǎn)少于理論數(shù)量的原理，將基因組序列數(shù)據(jù)劃分為多個(gè)離散的單體型域，在這些域中找出能夠區(qū)分各單體型域中單體型的最小SNP位點(diǎn)集作為T(mén)ag SNPs。Tag SNPs獲取的另一種方法是Halldorsson等［5］提出的基于預(yù)測(cè)精度的Tag SNPs選擇方法，即定義Tag SNPs為一個(gè)有限的特定SNP位點(diǎn)集合，該集合能夠重構(gòu)剩余的SNP位點(diǎn)(被標(biāo)記位點(diǎn)，Tagged SNP)?；谝陨显恚恍┯糜诤Y選Tag SNPs的軟件陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)。如通過(guò)Haploview軟件篩選Tag SNP;Seattle SNP不僅提供了部分Tag SNP信息，同時(shí)還提供了Tag SNP的選擇工具perl軟件。此外，可利用的公開(kāi)的網(wǎng)上資源包括Genome Variantion Server(http:∥gvs.gs.washington.edu/GVS/)和National Institute of Environmental Health Sciences(http:∥snpinfo.niehs.nih.gov/)，他們利用計(jì)算、實(shí)驗(yàn)、流行病學(xué)資料及GWAS、LD的結(jié)果和SNP功能預(yù)測(cè)信息篩選 Tag SNP。另外，HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥snp.cshl.org/)、NCBI SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、美國(guó) NIH 的癌癥和腫瘤相關(guān)候選 SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ipg.nci.nih.gov/)、歐洲SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.gwascentral.org/index)、日本SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥snp.ims.u-tokyo.ac.jp)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù) HGMD(http:∥www.hgmd.cf.no.uk/)、華盛頓大學(xué) SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ibc.wustl.edu/snp)、美國(guó)懷特和特研究所建立的人類(lèi)SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.genome.wi.nit.edu/SNP/human/index.html)、瑞典卡爾林斯卡研究院建立的數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥hgbase.cgr.ki.se)等都提供了豐富的 SNP信息。

1.3 Tag SNPs檢測(cè)方法

Tag SNPs的檢測(cè)方法一類(lèi)是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的經(jīng)典方法，包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、等位基因特異性PCR(ASPCR)等;另一類(lèi)是近些年來(lái)陸續(xù)發(fā)展起來(lái)的高通量、高自動(dòng)化的檢測(cè)方法，包括TaqMan探針技術(shù)、DNA芯片檢測(cè)、變性高效液相色譜、DNA測(cè)序法、基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)檢測(cè)及根據(jù)高分辨率溶解曲線(xiàn)(HRM)進(jìn)行分型檢測(cè)等。

2 Tag SNPs在腫瘤易感性研究中的應(yīng)用

目前，腫瘤發(fā)生相關(guān)SNPs研究集中于重要的癌基因、抑癌基因、關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因及一些重要功能基因中的單個(gè)或者多個(gè)SNP位點(diǎn)。腫瘤易感性的關(guān)聯(lián)研究經(jīng)歷了候選基因(candidate gene)策略、候選生物學(xué)通路(candidate biological pathway)策略和GWAS策略3種重要的SNPs候選策略。

2.1 Tag SNPs在基于候選基因策略中的應(yīng)用

候選基因法是選擇已知在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程如細(xì)胞周期控制、凋亡、DNA修復(fù)通路以及致癌物代謝中的關(guān)鍵基因，或腫瘤中明確存在體細(xì)胞突變的基因作為候選基因，運(yùn)用單倍型構(gòu)建Tag SNPs，通過(guò)病例-對(duì)照研究找出腫瘤易感基因。Wassenaar等［6］運(yùn)用Tag SNPs研究了尼古丁代謝的CYP2A6基因和尼古丁基因簇CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4(CHRNA5-A3-B4)，證實(shí)其多態(tài)性可增加肺癌風(fēng)險(xiǎn);Schonfeld等［7］通過(guò)病例-對(duì)照研究從58個(gè)候選基因的1 151個(gè)Tag SNPs鑒定出CYP19A1基因的4個(gè)SNPs與乳頭狀甲狀腺癌相關(guān);Wang等［8］從 HapMap、dbSNPs數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中篩選出XPF、MDM2基因的Tag SNPs，發(fā)現(xiàn)XPF基因啟動(dòng)子區(qū)-357A＞C多態(tài)變異通過(guò)影響XPF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，干擾膀胱癌的遺傳易感性和預(yù)后，位于MDM2啟動(dòng)子區(qū)的-1797C＞G多態(tài)與膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。以上這些多人群、多中心、大樣本甚至利用HapMap進(jìn)行候選基因單體型的研究，對(duì)定位腫瘤易感基因進(jìn)行了有益而可靠的探索。

候選基因法因?yàn)橛猩飳W(xué)基礎(chǔ)，所以在鑒定腫瘤候選基因時(shí)成功幾率大、結(jié)果易解釋、成本低廉。但是，該方法是在對(duì)候選基因充分認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上提出的假說(shuō)，因此，可能錯(cuò)過(guò)其它與疾病真正相關(guān)的位點(diǎn)。另外，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)并不排除同一基因中還存在其他重要Tag SNPs，與疾病關(guān)聯(lián)的Tag SNPs也不一定就是有功能的遺傳變異，這時(shí)就要進(jìn)行功能研究以證實(shí)哪個(gè)是致病性或功能性SNP。

2.2 Tag SNPs在候選生物學(xué)通路策略中的應(yīng)用

腫瘤的發(fā)生通常由細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)通路的紊亂所致，因此，基于某些重要的候選生物學(xué)通路研究策略應(yīng)運(yùn)而生。涉及到的通路包括DNA損傷修復(fù)通路、JAK-STAT通路、EGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期和凋亡等通路、葉酸代謝通路等。Zhang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1-509C＞T多態(tài)是影響結(jié)直腸癌易感性主要的多態(tài)位點(diǎn)，它和LTBP-1L GA/CC多態(tài)位點(diǎn)都可以顯著增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn);MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因MKK4啟動(dòng)子遺傳變異-1304T＞G與中國(guó)南方人群肺癌的高發(fā)相關(guān)［10］，T＞G的置換可明顯增加MKK4基因的轉(zhuǎn)錄水平;DNA損傷修復(fù)通路關(guān)鍵基因XRCC1的Arg194Trp和Arg280His多態(tài)能夠增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［11］;凋亡通路中的FASL-844T＞C多態(tài)能夠使個(gè)體罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［12］;IGF2基因SNPs與上皮性卵巢癌相關(guān)聯(lián)［13］，而VD通路的變異可能是非洲血統(tǒng)婦女雌激素受體陰性乳腺癌高發(fā)的原因［14］。

候選生物學(xué)通路法可以彌補(bǔ)候選基因法缺乏廣泛性和系統(tǒng)性的缺點(diǎn)，且具有明確的生物學(xué)機(jī)制，在鑒定腫瘤易感基因及分析基因聯(lián)合作用等方面具有預(yù)測(cè)精度高、假陽(yáng)性較低等顯著優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)取得了較多的研究成果，但是研究設(shè)計(jì)需要較大的樣本量，也需要根據(jù)現(xiàn)有的生物學(xué)通路提出假說(shuō)。

2.3 Tag SNPs在GWAS策略中的應(yīng)用

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃及單體型圖譜構(gòu)建的完成和高通量基因分型技術(shù)的快速發(fā)展，人們開(kāi)始采用GWAS策略對(duì)腫瘤致病基因位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。GWAS［15］是根據(jù)LD的原理，選擇數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的Tag SNPs以涵蓋人類(lèi)全基因組范圍的遺傳變異，比較病例-對(duì)照組多態(tài)位點(diǎn)的頻率差異來(lái)尋找全基因組中與疾病相關(guān)的易感基因，是目前搜尋腫瘤等復(fù)雜疾病易感基因的最有效方法。Amos等［16］通過(guò)選取315 450個(gè)Tag SNPs位點(diǎn)對(duì)肺癌進(jìn)行GWAS研究，從而把肺癌的易感基因定位于15q25.1。乳腺癌GWAS結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 FGFR2(rs2981582)、TNRC9/LOC643714(rsl2443621)、MAP3KI(rs889312)和 LSPl(rs3817198)、8q24的 rsl3281615等5個(gè)乳腺癌的易感位點(diǎn)［17］，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新線(xiàn)索，為乳腺癌高危人群的篩選和個(gè)性化預(yù)防和治療開(kāi)辟了新思路;英國(guó)學(xué)者通過(guò)GWAS驗(yàn)證了SMAD7基因與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)性［18］，對(duì)結(jié)直腸癌病理分期和預(yù)后判斷有一定意義。Cui等［19］報(bào)道了日本人群中食管癌的GWAS結(jié)果，隨后中美學(xué)者［20-21］陸續(xù)發(fā)表了食管癌的GWAS研究成果。至今，研究人員已經(jīng)對(duì)400余種復(fù)雜疾病開(kāi)展了近1 500項(xiàng)GWAS研究，發(fā)現(xiàn)了一大批易感基因或位點(diǎn)，其中近300項(xiàng)研究成果發(fā)表在 New Engl J Med、Science、Nature和 Nat Genet等國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)刊物上［22］。

選擇基因組中的Tag SNPs進(jìn)行GWAS研究大大減少了工作量，但是不能完全捕獲全部基因組的SNP變異。另外，GWAS的結(jié)果存在假陽(yáng)性、假陰性、檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性很少位于功能區(qū)以及對(duì)稀有變異不敏感等問(wèn)題，導(dǎo)致了其應(yīng)用的局限性［23］。正如Nancy Cox教授所說(shuō):“GWAS研究的結(jié)果到臨床應(yīng)用的路上仍然布滿(mǎn)荊棘”［24］。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

選擇和使用Tag SNPs極大地促進(jìn)了在基因組水平范圍內(nèi)確定腫瘤易感基因，對(duì)腫瘤高危人群的篩選、危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)及預(yù)警、輔助分子診斷、腫瘤的治療、預(yù)后判斷及腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)等都具有重大意義。目前，利用Tag SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)鑒定出包括乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等一系列腫瘤的易感基因。但是，基于Tag SNPs的關(guān)聯(lián)研究也存在諸如Tag SNPs位點(diǎn)選取存在復(fù)雜度高、限制條件多、精確度低等缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致假陽(yáng)性、假陰性等問(wèn)題。同時(shí)，腫瘤具有遺傳異質(zhì)性，存在種族差異，一個(gè)Tag SNPs并不能完全解釋某些腫瘤發(fā)生的原因。此外，相當(dāng)一部分Tag SNPs被證實(shí)在基因組的非編碼區(qū)，從非功能性Tag SNPs中找出功能性將是一項(xiàng)更大的挑戰(zhàn)［25］。所以，在選取Tag SNPs時(shí)盡可能結(jié)合多個(gè)軟件和采用多種方法，對(duì)關(guān)聯(lián)程度高的位點(diǎn)進(jìn)行多種族、多群體、大樣本的重復(fù)驗(yàn)證研究，并進(jìn)一步利用細(xì)胞或動(dòng)物模型進(jìn)行證實(shí)，將有助于明確基因在腫瘤發(fā)生中的作用。可喜的是，隨著功能基因組研究的深入，原來(lái)的研究方法不僅得以補(bǔ)充和發(fā)展，一些新的如外顯子測(cè)序策略［26］、系統(tǒng)生物學(xué)策略等陸續(xù)出現(xiàn)，腫瘤易感性研究必將迎來(lái)一個(gè)更加廣闊的發(fā)展空間。

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