一種快速檢測(cè)食用油中黃曲霉毒素B1的膠體金試劑板的研制

陳笑笑 桑麗雅 李 康 胡葉軍 盛慧萍

（杭州南開日新生物技術(shù)有限公司1，杭州 310022）

（杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院2，杭州 310022）

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)的一種真菌有毒代謝產(chǎn)物，其基本結(jié)構(gòu)由一個(gè)二呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)M成（即香豆素），主要成分包括 6種：即 B1、B2、G1、G2、M1、M2［1－2］。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)。生產(chǎn)企業(yè)如果使用劣質(zhì)的原料，如發(fā)霉的花生、菜籽、玉米等生產(chǎn)食用油，則有可能造成黃曲霉素超標(biāo)，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成威脅。

黃曲霉毒素危害性大，存在范圍廣，黃曲霉毒素B1對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染，不僅影響了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，嚴(yán)重威脅到人民消費(fèi)安全和身體健康，還降低了農(nóng)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，影響農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)聲譽(yù)。為了預(yù)防黃曲霉毒素中毒事件的發(fā)生，維護(hù)人類健康，幾乎所有國(guó)家和地區(qū)都規(guī)定了農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中AFB1的最大允許含量，并作為強(qiáng)制性檢測(cè)項(xiàng)目［3－4］。

目前，測(cè)定食品中黃曲霉毒素的方法有薄層層析法、液相色譜法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法、微柱篩選法、金標(biāo)試紙法等。這些檢測(cè)方法大多需要專門的儀器設(shè)備并且操作繁瑣，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求，而且檢測(cè)成本較高。自乳業(yè)中被檢出黃曲霉毒素M1事件后，據(jù)質(zhì)檢總局公布的食用植物油產(chǎn)品抽查情況，廣州、深圳等多家食用油廠家生產(chǎn)的食用油產(chǎn)品被檢出致癌物質(zhì)黃曲霉毒素超標(biāo)。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、高效的食用油中AFB1檢測(cè)方法具有重要的意義。［5－6］

本試驗(yàn)以單克隆抗體（McAb）和免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)（ILT）為基礎(chǔ)，研制了一種食用油中AFB1免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板，可一步式定性測(cè)定食用油中AFB1。試劑的靈敏度等性能優(yōu)于現(xiàn)有的黃曲霉毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、無須輔助儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的初步篩選和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。［7］

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

BioJet XYZ3000型點(diǎn)膜儀：美國(guó)BioDot公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊：Millipore公司；Bradford蛋白定量試劑盒：Bio－Rad公司；黃曲霉毒素ELISA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Beacon公司；酶標(biāo)微孔：美國(guó)Corning公司。

1.1.2 藥品和試劑

氯金酸（HAuCl4·4H2O）、黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品、羊抗鼠IgG：Sigma公司；甲醇、正己烷：華東醫(yī)藥有限公司；黃曲霉毒素 B1－牛血清蛋白偶聯(lián)物（AFB1－BSA）、抗黃曲霉毒素單克隆抗體：杭州南開日新生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 黃曲霉毒素B1特異性結(jié)合抗原的制備及鑒定

1.2.1.1 通過衍生化反應(yīng)，合成AFB1羧甲基活化物

10 mg AFB1溶于6 mL［（V（甲醇）∶V（水）∶V（吡啶）＝4∶1∶1）］混合液中，加入 20 mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽，85℃回流3 h，室溫放置過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸除溶劑。

所得沉淀物用少量氯仿溶解，以V（氯仿）∶V（甲醇）＝9∶1為展開劑，與標(biāo)準(zhǔn)AFB1的展開值Rf進(jìn)行對(duì)照，Rf值為0.25左右的是AFB1的活化物，Rf值為0.75左右的組份是沒有轉(zhuǎn)化的AFB1，收集活化物組份，待第二次薄層層析進(jìn)行純化。收集AFB1活化物，用少量的甲醇溶解，待用。

1.2.1.2 利用碳二亞胺法合成AFB1完全抗原

取AFB1活化物5 mg于5 mL的磨口燒瓶中，加5 mL無水二甲基甲酰胺（DMF）溶液使其溶解，置于4℃冰箱中冷卻，取50 mg碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶于1.0 mL蒸餾水中，取44 mg BSA溶于4.0 mL 0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，冰箱中冷卻待用。

在磁力攪拌的同時(shí)，將0.5 mL EDC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌。避光反應(yīng)1 h。在反應(yīng)液中緩慢滴加BSA溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h后，再加入0.5 mL EDPC溶液，4℃下反應(yīng)16 h。將產(chǎn)物溶液用0.01 mol／L PBS溶液在4℃下透析72 h，每12 h換透析液1次，用小瓶分裝，真空冷凍干燥后，置4℃保存。1.2.1.3 抗原的鑒定

合成的黃曲霉毒素特異性結(jié)合抗原（AFB1－BSA）稀釋成100μg／mL（蛋白質(zhì)量濃度），然后做200～400 nm波長(zhǎng)的紫外掃描。比較半抗原、載體蛋白和偶聯(lián)物的紫外光譜圖，判斷偶聯(lián)是否成功。

1.2.2 抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備按常規(guī)方法制備［8］。

1.2.3 金標(biāo)抗體的制備

1.2.3.1 膠體金溶液的制備

檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液：取0.01%氯金酸水溶液100 mL用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2.5 mL，繼續(xù)攪拌加熱10 min，溶液呈透亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 黃曲霉毒素B1單克隆抗體的標(biāo)記

取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入黃曲霉毒素B1單抗2 mg，攪拌15 min，逐滴加入2.5 mL 25 mg／mL聚乙二醇 20 000（PEG 20 000），攪拌 20 min。20 000 r／min離心20 min，棄上清液，加入 10 mL pH 7.4 PBS緩沖液（含0.4 mg／mL PEG）清洗2次。將沉淀用5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%BSA的PBS緩沖液（pH 7.4）溶解，用0.22μm無菌過濾器過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 T線、C線工作濃度的確定及C線、T線、金標(biāo)抗體包被量配比的確定

1.2.4.1 T線工作濃度的確定

將包被抗原AFB1－BSA用稀釋液稀釋成系列工作濃度，按常規(guī)噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為T線，同時(shí)將羊抗鼠IgG稀釋成1.2 mg／mL按常規(guī)噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線，上述NC膜烘干后與膠體金結(jié)合墊等組裝成試紙條，用0.01 mol／L pH 7.4的PBS滴定，觀察T線顯色強(qiáng)度及顯色穩(wěn)定性情況，通過對(duì)T線的工作濃度的粗調(diào)至細(xì)調(diào)，最終確定T線的工作濃度范圍。

1.2.4.2 C線工作濃度的確定

根據(jù)T線工作濃度范圍，將羊抗鼠IgG設(shè)置系列濃度按常規(guī)噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線，與膠體金結(jié)合墊組裝后，用PBS液滴定，選擇C線顯色深度適中、比T線略淺或與T線一樣深的濃度作為C線工作濃度。

1.2.4.3 C線、T線、金標(biāo)抗體包被量配比的確定

在T線工作濃度范圍內(nèi)，選擇一個(gè)適中濃度按常規(guī)噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為T線；將確定的C線工作濃度以常規(guī)噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線；將金標(biāo)抗體包被到金標(biāo)微孔中，包被量在0.8～2.0μL／cm范圍內(nèi)設(shè)置系列濃度；上述材料組裝成試紙條后，用PBS液和不同濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品液滴定，根據(jù)顯色情況和試紙靈敏度，選擇適宜的金標(biāo)抗體包被量。

確定了金標(biāo)抗體包被量后，再細(xì)調(diào)C、T線包被濃度配比，最終確定C線、T線及金標(biāo)抗體的包被量配比。

1.2.5 試劑板各組分的優(yōu)化、組裝

用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的AFB1－BSA及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測(cè)線（T）和控制線（C），在33℃烘箱干燥12 h。將制備好的金標(biāo)記抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體包被到微孔中，33℃烘箱干燥12 h。

檢測(cè)試劑板由PVC背襯，及其上按順序黏著的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊（圖1）組成。用切割機(jī)將貼好的板切割成3.84 cm寬的條，裝入模板中制成檢測(cè)試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。

圖1 黃曲霉毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.6 試劑板的操作方法

1.2.6.1 樣品制備

樣本處理過程：吸取1 mL食用油于5 mL離心管中；加入1 mL正己烷和1 mL甲醇，劇烈震蕩1 min，靜置1 min（明顯分層）；吸取0.5 mL上層溶液于一新的5 mL離心管中，60℃下空（氮）氣吹干。向吹干的離心管中加入2.5 mL黃曲霉毒素B1專用復(fù)溶液，沖洗管內(nèi)壁，充分溶解殘留物后，待檢。

1.2.6.2 使用方法

吸取100μL待檢樣品溶液于已包被了金標(biāo)的微孔中，用滴管吹打均勻，靜置反應(yīng)5 min，吸取全部混合溶液于試劑板加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在5～8 min讀取，其他時(shí)間判讀無效，讀取結(jié)果時(shí)，試劑板應(yīng)置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。

圖2 試劑使用方法

1.2.6.3 結(jié)果判定

當(dāng)檢測(cè)試樣滴于加樣孔時(shí)，由于毛細(xì)作用液體向前移動(dòng)。到達(dá)T線時(shí)，試樣中的黃曲霉毒素B1與固定在T線上的AFB1－BSA復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗黃曲霉毒素B1單抗－膠體金復(fù)合物，可出現(xiàn)以下幾種情況（圖3）。

圖3 陰陽性結(jié)果判定圖

1.2.7 試劑板靈敏度的測(cè)定

添加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備成不同質(zhì)量濃度的分析試樣溶液：0、0.2、0.5、1、2、3μg／L，用檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，5 min后觀察結(jié)果。

1.2.8 試劑板特異性的測(cè)定

將黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素分別溶于PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol／L），各配成5、10、20、50、100μg／L的質(zhì)量濃度，然后用檢測(cè)試劑板檢測(cè)。

1.2.9 試劑板假陽性率和假陰性率測(cè)定

經(jīng)HPLC法［9］檢測(cè)為黃曲霉毒素B1陰性（黃曲霉毒素B1含量均小于0.1μg／L）和陽性添標(biāo)樣品（黃曲霉毒素B1含量均大于0.5μg／L）的食用油樣品各50份，用本研究制備的試劑板進(jìn)行測(cè)定，比較檢測(cè)結(jié)果。

1.2.10 試劑板穩(wěn)定性測(cè)定

用來自同一批次中的不同檢測(cè)試劑板檢測(cè)同一樣品，比較檢測(cè)結(jié)果。

將相同批次的試劑板分別于33℃、室溫、4℃密閉保存3個(gè)月，每隔2周分別檢測(cè)陽性和陰性水產(chǎn)樣品各20份。

1.2.11 試劑板與儀器方法的比對(duì)

將10份不同的油樣用本研究制備的試劑板進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用HPLC法進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉毒素特異性結(jié)合抗原的鑒定

AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外掃描圖譜見圖4。從圖譜分析，偶聯(lián)后AFB1－BSA的特征吸收波峰發(fā)生偏移，根據(jù)吸光度加合性原理，表明偶聯(lián)成功。

圖4 AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外掃描圖譜

2.2 檢測(cè)試劑板的制備

將不同質(zhì)量濃度的AFB1－BSA、羊抗鼠IgG、黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復(fù)合物分別包被在硝酸纖維素膜和酶標(biāo)微孔中，反復(fù)調(diào)試，使最終的靈敏度達(dá)到檢測(cè)所需的要求。其具體用量如下：黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復(fù)合物采用OD值為10（包被量10μL／孔）的包被量，檢測(cè)線 AFB1－BSA用量為 0.8 mg／mL（噴量1.0μL／cm），控制線羊抗鼠IgG用量為1 mg／mL（噴量1.0μL／cm）。

試驗(yàn)結(jié)果表明：①采用不同 pH值 5、6、7、8、9、10的樣品墊對(duì)試劑板的靈敏度沒有產(chǎn)生明顯影響。②將硝酸纖維素膜用各種不同配比的溶液做封閉，發(fā)現(xiàn)試劑條的C、T線顯色都變淺，但對(duì)靈敏度和特異性沒有明顯影響，所以最終制備檢測(cè)試劑時(shí)沒有采用封閉的方案。③經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，若C、T線的質(zhì)量濃度和噴量以及抗體－膠體金復(fù)合物的OD值相同，采用12μm和5μm這兩種不同孔徑的硝酸纖維素膜，后者做成的試劑板靈敏度更高一些。④在制備好的抗體－膠體金復(fù)合物中加入不同比例的蔗糖和海藻糖，會(huì)對(duì)膠體金復(fù)合物從膠體金結(jié)合墊上的釋放能力產(chǎn)生影響，在一定范圍內(nèi)，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，膠體金復(fù)合物釋放得越快。

采用半抗原偶聯(lián)率比較高的AFB1－BSA做成的試劑板靈敏度更高，這同偶聯(lián)比率高的AFB1－BSA與黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)的能力更強(qiáng)有關(guān)。但如果半抗原偶聯(lián)率過高，則會(huì)出現(xiàn)線條過細(xì)，顯色梯度不明顯，跑板差等現(xiàn)象，不適用于檢測(cè)試劑板的研制。

本試劑板采用的檢測(cè)操作過程中，對(duì)比三氯甲烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等常規(guī)提取劑，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率較高，價(jià)格便宜，且毒性及對(duì)環(huán)境的影響較其他試劑小很多，適用于本試劑板的樣本提取。樣本提取過程盡量避免使用比較昂貴儀器，采取盡可能簡(jiǎn)潔的步驟。通過反復(fù)試驗(yàn)，本試劑板最終采用提取、吹干、復(fù)溶的提取方法，通過濃縮提高了試劑板的檢測(cè)線。針對(duì)不同使用者所需的檢測(cè)線各異，本方法中可以通過增加復(fù)溶液量，降低試劑板的檢出線。根據(jù)使用復(fù)溶液量的梯度建立試劑板的檢測(cè)線梯度，使同一試劑板可以具有不止一個(gè)檢測(cè)線。

2.3 檢測(cè)的靈敏度

不同質(zhì)量濃度的分析試樣溶液經(jīng)試劑板檢測(cè)，檢測(cè)顯色結(jié)果如圖5所示，從圖5可以看到隨著添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，檢測(cè)線（T線）顯色強(qiáng)度呈梯度遞減。當(dāng)試樣中AFB1質(zhì)量濃度小于0.5μg／L時(shí)，檢測(cè)線顯色比控制線深或與控制線在肉眼下沒有明顯區(qū)別。當(dāng)試樣中AFB1質(zhì)量濃度大于等于0.5μg／L時(shí)，檢測(cè)線顯色比控制線淺。當(dāng)試樣中的AFB1濃度大于2μg／L時(shí)，檢測(cè)線完全消失。

由此初步確定，本檢測(cè)試劑板對(duì)食用油中黃曲霉毒素B1的最低檢測(cè)水平（LDL）可達(dá)到0.5μg／L。

圖5 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品滴板后顯色變化圖

2.4 檢測(cè)的特異性

檢測(cè)結(jié)果見表1，由表1可知，試劑板只針對(duì)AFB1有特異性結(jié)合，與其他真菌毒素沒有交叉反應(yīng)。

表1 黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)試劑板的特異性

2.5 假陰性率和假陽性率

50份經(jīng)HPLC法確證陰性的食用油樣品用本研究制備的試劑板檢測(cè)，2個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陽性，其余48個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，故試劑板的假陽性率為4%。

50份經(jīng)HPLC法確證黃曲霉毒素B1含量大于0.5μg／L的食用油樣品用本研究制備的試劑板檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示均為陽性，故試劑板的假陰性率為0。

2.6 試劑板的穩(wěn)定性

經(jīng)驗(yàn)證表明，不同批次的檢測(cè)試劑板測(cè)定同一樣品，其檢測(cè)限、控制線的顯色時(shí)間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀基本相同。

試劑板分別于33℃、室溫、4℃密閉保存3個(gè)月，每隔2周分別檢測(cè)陽性和陰性水產(chǎn)樣品各20份，結(jié)果顯示隨著時(shí)間和溫度的變化，檢測(cè)結(jié)果均未發(fā)生顯著變化。根據(jù)33℃下一天相當(dāng)于室溫下1周計(jì)算，本試劑板可以在室溫下保存12個(gè)月［10］。

2.7 試劑板與儀器方法的比對(duì)結(jié)果

10份油樣經(jīng)本研究試劑板（GICA法）和HPLC法檢測(cè)，結(jié)果見表2，兩種方法結(jié)果一致。

表2 GICA和HPLC檢測(cè)結(jié)果的比較

3 結(jié)論

本研究研制的檢測(cè)試劑板，與其他的檢測(cè)手段相比，最大的特點(diǎn)是快，可以在20 min內(nèi)得到結(jié)果；整個(gè)檢測(cè)過程無需接觸毒性很大的黃曲霉毒素；操作方便，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)樣本檢測(cè)；檢測(cè)成本低廉。作為一種快速篩查檢測(cè)的方法，有利于食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)和監(jiān)控，具有重要價(jià)值。

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