桑椹及桑椹酒白藜蘆醇的含量變化

朱祥瑞，章本學(xué)，楊逸文，蔡志偉，占鵬飛

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313060）

桑椹及桑椹酒白藜蘆醇的含量變化

朱祥瑞1，章本學(xué)2，楊逸文2，蔡志偉2，占鵬飛3

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313060）

為探索人為控制提高桑椹與桑椹酒白藜蘆醇含量，采用UV-C照射桑椹，于20±1℃避光放置后，進行發(fā)酵。試驗結(jié)果顯示：照射強度為0.6～3.6 KJ/m2的UV-C照射桑椹后避光放置，均可不同程度誘導(dǎo)白藜蘆醇產(chǎn)生；添加果膠酶能提高桑椹酒白藜蘆醇的含量，最高可以提高56%；桑椹酒發(fā)酵至96 h時，白藜蘆醇含量達到最大值。

桑椹；桑椹酒；白藜蘆醇；控制

桑椹（Fructusmori）因含有多種營養(yǎng)成分，如?；ㄇ嗨?、蕓香苷、胡蘿卜素、維生素，多種礦物質(zhì)和微量元素等，逐漸被消費者認可和接受。還因桑椹含有白藜蘆醇等功能性成分，而受到重視［1］。

隨著對桑椹研究的深入及大眾對桑椹產(chǎn)品保健功能的認知和接受，相關(guān)的桑椹產(chǎn)品，如桑果酒、桑果凍、桑椹膏、桑椹紅色素等，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，其中桑椹酒是最具影響力和發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品。

白藜蘆醇（resveratrol）是桑椹酒產(chǎn)品的一個重要的功能性成分，也是桑椹酒市場競爭力的一個重要因素。為此，研究桑椹酒釀制前后，桑椹中白藜蘆醇的含量變化以及人為調(diào)控的方法，對于保持和有限提高桑椹酒中白藜蘆醇含量，有著重要意義。本文就桑椹采摘后和桑椹酒釀制中的白藜蘆醇含量的變化，以及人為調(diào)節(jié)的方法進行了小結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹：大10成熟果實，2013年5月中旬采摘于安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司馬村桑園。

白藜蘆醇標準樣品：美國Sigma Chemical Co．LTD產(chǎn)品。

乙腈：美國霍尼韋爾公司（Honeywell）色譜級產(chǎn)品。

酵母：LAFFORT F33，法國LAFFORT公司產(chǎn)品。

果膠酶：法國LAFFORT果酒專用果膠酶。

1.2 儀器

LC-6A高效液相色譜儀、UV檢測器：日本島津公司。

色譜柱：Hypersil ODS柱（250 mm×416 mm，μm），美國Thermo Scientific公司。

分析天平：賽多利斯BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

發(fā)酵罐：RAT-5型5 L雙層玻璃反應(yīng)釜，予華儀器有限公司。

紫外燈管：UV-C紫外燈管（15W），飛利浦公司。紫外線檢測儀：北京師范大學(xué)光電儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桑椹紫外線處理

將裝有UV-C（200～275 nm，中心波長254 nm）紫外燈管的照射架放置在操作臺上。通過調(diào)節(jié)燈管到操作臺面的距離，以確定紫外輻照的強度為2 w/m2［2］。照射輻照強度用紫外檢測儀測定。

選取成熟適度的大10桑椹，放置與操作臺上，攤薄，能使紫外光照射到每顆桑椹。分別照射0、5、10、15、20、25、30 min，UV-C的照射強度分別為0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 KJ/m2。每隔2 min，翻動桑椹1次，使紫外線均勻照射到桑椹。紫外線照射后的桑椹于培養(yǎng)箱（20±1℃）中避光放置24 h［3～4］。

在培養(yǎng)箱中放置的桑椹，每隔4 h取樣1次，樣品速凍后冰箱保存。

1.3.2 桑椹酒釀制方法

（1）酵母準備：將LAFFORT F33酵母緩慢的加入到其10倍質(zhì)量的37℃的熱水中，攪拌溶解，活化，靜置2 min，備用。

（2）原料準備：將紫外線照射25 min（3 KJ/m2）后的桑椹樣品，解凍后，用破碎機破碎，投入發(fā)酵罐，添加LAFFORT果酒專用果膠酶，用量為0.2 g/L，并適量添加亞硫酸鹽溶液，添加量為20 mg/L，充分攪拌。對照，不添加果膠酶。

（3）糖酸度調(diào)整：根據(jù)桑椹本身糖度以及桑椹酒酒度（10°）要求，添加一定量的食糖，調(diào)整桑椹汁糖度至250 g/L。按桑椹酒要求，調(diào)整酸度至6 g/L。

（4）發(fā)酵：活化后的酵母，按一定比例用量，加入到桑椹汁中充分攪拌，在20～24℃下發(fā)酵，當殘?zhí)切∮?.0 g/L時，結(jié)束主發(fā)酵［5］。

發(fā)酵過程中，每隔24 h抽樣，進行白藜蘆醇分析。

1.3.3 白藜蘆醇標準樣品的制備

精密稱取白藜蘆醇標準樣品2.5 mg，用無水乙醇溶解并定容于25 ml容量瓶中。

1.3.4 標準曲線的繪制

分別吸取白藜蘆醇標準樣品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m l，用無水乙醇定容于100 m l容量瓶中，搖勻，得濃度分別為1、2、3、4、5 mg/L白藜蘆醇標準系列。以無水乙醇為空白對照，各進樣10μl，在306 nm波長下進行HPLC分析。以樣品白藜蘆醇量為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），計算曲線方程（n=5）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.3.5 桑椹及桑椹酒試樣的制備

（1）UV-C照射桑椹不同時間后的樣品，解凍、高速勻漿，微孔過濾，收集濾，待檢測。

（2）添加不同量酵母的桑椹汁，開始發(fā)酵后，每24 h取樣1次，樣品離心（6000 r/min，15 min）后，冰箱-40℃保存，待檢測。對照樣品（不添加果膠酶），處理相同。

1.3.6 桑椹和桑椹酒試樣的HPLC測定

（1）色譜條件

流動相：乙腈∶水（35∶65）

檢測波長：306 nm

柱溫：室溫

流速：1m l/min進樣：10μl

（2）樣品分析

在與測定白藜蘆醇標準樣品相同的條件下，測試桑椹和桑椹酒試樣的白藜蘆醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇標準曲線

白藜蘆醇標準樣品的HPLC圖譜見圖1。

以白藜蘆醇標準樣品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，繪制標準樣品的標準曲線見圖2。

2.2 紫外線對桑椹白藜蘆醇的誘導(dǎo)

桑椹經(jīng)UV-C不同強度照射，經(jīng)遮光保存一定時間后，桑椹內(nèi)白藜蘆醇含量變化見圖3。

圖3顯示，未經(jīng)紫外線照射的桑椹，從0～4 h，白藜蘆醇含量稍有增加，隨后便開始下降。經(jīng)不同強度紫外線照射后，避光保存0～16 h，桑椹白藜蘆醇含量均有一定程度的增加，16 h后開始下降；紫外線照射強度為3.6 KJ/m2，桑椹白藜蘆醇產(chǎn)生的量最多，最高達16.3mg/L；遮光放置0～24 h，桑椹白藜蘆醇均有增加，其中0～12 h，白藜蘆醇含量的增加呈上升趨勢，12 h后，含量呈下降。

以上情況說明，經(jīng)紫外線照射后的桑椹，避光放置12 h后，白藜蘆醇含量比初始值有一定的上升；紫外線照射強度，在0.6 KJ/m2～3.6 KJ/m2范圍內(nèi)，隨著強度的增加，白藜蘆醇含量都有所增加。與未經(jīng)紫外線照射的桑椹比較，白藜蘆醇含量均有一定的上升。

圖1 白藜蘆醇標樣HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of resveratrolstandard sample

圖2 白藜蘆醇標準曲線Fig.2 Standard curve of resveratrol

圖3 不同強度紫外線照射后桑椹白藜蘆醇含量的變化Fig.3 Resveratrol content change ofmulberry fruitafter UVC dosagesirradiation

2.3 桑椹酒發(fā)酵條件的選擇

桑椹汁添加一定量的酵母后，在20～24℃下進行主發(fā)酵。

酵母添用量與桑椹酒發(fā)酵液中糖含量的關(guān)系見圖4。

圖4 不同酵母用量與糖含量的關(guān)系Fig.4 The relation between the amountof yeastand the sugar content

從圖4可知，酵母用量為250 mg/L的樣品，發(fā)酵到第4 d時，糖含量剩下4.7 g/L，主發(fā)酵基本完成；其他的也接近5 g/L；發(fā)酵至第5 d，各組的含糖量均下降至5 g/L以下。其中，200 mg/L酵母用量的發(fā)酵效果，非常接近于250mg/L的效果。

酵母添用量與桑椹酒發(fā)酵液中酒精含量的關(guān)系見圖5。

圖5 不同酵母用量與乙醇含量的關(guān)系Fig.5 The relation between the amount of yeast and the ethanol content

從圖5可知，發(fā)酵至第4 d，乙醇產(chǎn)生量開始變緩。酵母添加量為200 mg/L與250 mg/L的效果接近，乙醇含量分別達到9.9%和10.1%。結(jié)合對發(fā)酵酸的考察以及經(jīng)濟的考慮，認為200 mg/L酵母用量比較合適。

2.4 桑椹酒發(fā)酵條件對白藜蘆醇含量的影響

未添加果膠酶發(fā)酵至第4 d的桑椹酒白藜蘆醇的HPLC圖譜，見圖6。

圖6 桑椹酒白藜蘆醇HPLC圖譜（發(fā)酵第4 d）Fig.6 HPLC chromatogram of resveratrol inmulberry wine（4th day of fermentation）

每24 h抽取發(fā)酵樣品，測定白藜蘆醇含量，結(jié)果見圖7。

圖7 果膠酶對桑椹酒白藜蘆醇含量的影響Fig.7 Effect of pectinase on resveratrol content in mulberry wine

圖7顯示桑椹酒中的白藜蘆醇含量隨著發(fā)酵，有一定程度的提高；發(fā)酵到第4 d時，白藜蘆醇含量到達最高；添加果膠酶有利于桑椹酒中白藜蘆醇含量的提高，最高的達3.9 mg/L，比未添加果膠酶的2.5mg/L，增加了1.4mg/L，增幅達56%。

3 結(jié)果與討論

3.1 桑椹采摘后經(jīng)紫外線UV-C照射后，于避光放置一定時間后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生白藜蘆醇

紫外線照射是一種非生物脅迫因子。根據(jù)其波長，紫外光可分為UV-A（315～390 nm），可以全部通過臭氧層，達到地面；UV-B（280～315 nm）部分被臭氧層吸收，部分到達地面；而UV-C（200～275 nm），則幾乎全部被臭氧層吸收。這意味著UC-A和UC-B對于桑椹等植物，已習(xí)以為常，沒有誘導(dǎo)合成白藜蘆醇的作用。而UV-C在自然條件下，因為劑量非常小，對桑椹合成白藜蘆醇也不起作用，因此，通過人工提高UV-C的照射劑量，可以誘導(dǎo)桑椹合成白藜蘆醇［2］。

3.2 紫外線照射強度以及避光放置時間對白藜蘆醇的誘導(dǎo)有相關(guān)性

UV-C照射強度越強，誘導(dǎo)桑椹產(chǎn)生的白藜蘆醇越多。

照射后，避光放置12 h內(nèi)，白藜蘆醇含量增加，隨后下降。為此，利用紫外線照射誘導(dǎo)產(chǎn)生白藜蘆醇，需在避光12 h內(nèi)使用。鑒于實際條件，本實驗采用3 KJ/m2UV-C照射后，避光放置了20 h后的桑椹為原料進行發(fā)酵，白藜蘆醇含量沒有達到理想水平。

3.3 使用果膠酶釀制桑椹酒，控制發(fā)酵時間，可以提高白藜蘆醇含量

添加0.2 g/L釀酒專用果膠酶，可以提高桑椹酒白藜蘆醇的含量；而且，發(fā)酵96 h后白藜蘆醇含量達到最大值。為此，可以通過控制酵母量的添加，進而控制發(fā)酵完成的時間，以求桑椹酒白藜蘆醇含量達到最大值。

3.4 桑椹酒發(fā)酵時，酵母添加量與主發(fā)酵完成有一定的關(guān)系

在實驗范圍內(nèi)，控制酵母添加量為200 mg/L為比較合適的用量，可以使得主發(fā)酵基本完成，同時可以保證白藜蘆醇含量處于一個比較高的位置。

［1］劉兆平，霍軍生.白藜蘆醇生物作用研究新進展［J］.國外醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生學(xué)分冊），2O02，（29）3：146～147.

［2］榮瑞芬，馮雙慶，戴蘊青.短波紫外線照射對葡萄采后發(fā)病率及白藜蘆醇化合物的影響［J］.保鮮與加工，2005，28（3）：8～9.

［3］Langcake P，Pryce R J.The production ofresveratrol an d the viniferins by grapevines in response to ultraviolet irradiation［J］.Phyto-chem istry，1977，16：1193～1196.

［4］李景明，馬麗艷，劉艷娜.葡萄采后紫外線（UV）處理對白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用［J］，中外葡萄與葡萄酒，2004.4：16～19.

［5］馬佩選.葡萄酒質(zhì)量與檢驗［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

Content Changes of Resveratrol in Mulberry Fruit and Mulberry Wine

ZHU Xiang-rui1,ZHANG Ben-xue2,YANG Yi-wen2,CAIZhi-wei2,ZHAN Peng-fei3
（1.Institute ofapplied bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.AnjiChaolongSericultural Development Company,Anji 313300 Zhejiang,China; 3.Huzhou Academy ofAgricultural Science,Huzhou 3130600 Zhejiang,China）

To investigate the content change of resveratrol in fresh mulberry fruit and mulberry wine,the experimentwas carried out:UV-C irradiated mulberry fruit for severalminutes,and storage in dark place at 20±1℃,then ferment.The experiment result showed that the intensity of radiation tomulberry fruit from 0.6 to 3.6 KJ/m2and keep it in darkness, it could inducedresveratrol.The experiment also indicatedthat added pectinase,it could increased resveratrol content in mulberry wine,themaxwas raised 65%;when ferment for 96 h,the resveratrol content reached highest.

freshmulberry fruit;mulberrywine;resveratrol;control

S886.9

A

0258-4069［2013］03-032-04

湖州市科技局攻關(guān)計劃農(nóng)業(yè)項目（編號：2012C22154）

朱祥瑞（1957-），男，博士，副教授。主要從事蠶業(yè)資源開發(fā)利用的教學(xué)科研和推廣。E-mail：xrzhu@zju.edu.cn