單管一步甲基化可變位點分析技術(shù)

岳陽陽，趙貴森，張倩，魯滌，翟仙敦，莫耀南

（1.河南科技大學法醫(yī)學院，河南洛陽 471003；2.中國政法大學證據(jù)科學教育部重點實驗室，北京 100088）

單管一步甲基化可變位點分析技術(shù)

岳陽陽1，2，趙貴森1，2，張倩1，魯滌2，翟仙敦1，莫耀南1

（1.河南科技大學法醫(yī)學院，河南洛陽 471003；2.中國政法大學證據(jù)科學教育部重點實驗室，北京 100088）

目的建立單管一步甲基化可變位點（methylation variable position，MVP）分析技術(shù)——單管消化后PCR鏈融解曲線分析（post-digestion PCR-melting curve analysis，PDP-MCA）。方法以文獻報道的差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR）為模型，在MVP兩側(cè)設(shè)計一組解鏈溫度各不相同的引物。應用FastDigest甲基化敏感性限制酶（methylation-sensitive restriction enzyme，MSRE），在同一反應管內(nèi)順次進行DNA的酶切、復合擴增和MCA檢測，生成MCA圖譜。同時用該方法和傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA技術(shù)檢測相同樣品（外周靜脈血、精液、陰道液各5份），比較兩種方法檢測結(jié)果，驗證其可行性，并分析比較不同樣品的MCA/HRM圖譜。結(jié)果解鏈溫度相差2℃以上的片段，MCA峰分離良好，復合擴增后可以用MCA技術(shù)檢測。應用單管PDP-MCA技術(shù)，可以集酶切、擴增和檢測三步于一管，在2h內(nèi)得到與傳統(tǒng)方法一致的特異性圖譜和數(shù)據(jù)，并實現(xiàn)樣品的快速分類鑒別。結(jié)論單管PDP-MCA技術(shù)可以實現(xiàn)多個MVP的單管、閉管檢測，具有簡便、快速、易于自動化等優(yōu)點，可用于樣品DNA甲基化差異的檢測。

法醫(yī)遺傳學；DNA甲基化；鏈融解曲線；甲基化敏感性限制酶；甲基化可變位點

DNA甲基化是DNA的一種新型分子標記，與SNP等反映個體間差異的遺傳標記不同，主要表現(xiàn)為個體內(nèi)細胞間的差異。甲基化可變位點（methylation variable position，MVP）被視為表觀遺傳學水平上的“SNP”[1]，即DNA鏈上表現(xiàn)出不同甲基化狀態(tài)的CpG位點，這種差異存在于正常的細胞類型之間以及細胞的不同發(fā)育階段。基因組內(nèi)廣泛存在的MVP為解決法醫(yī)學問題提供了一種全新的途徑，國內(nèi)外學者正在探索利用DNA甲基化標記解決同卵雙生子鑒別、年齡推斷、斑痕類型鑒別、人造DNA鑒偽等問題[2-8]。細胞類型的差異導致了不同組織間的特異性甲基化模式即組織特異性差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR），因而通過分析檢材的甲基化特征，就可推斷其組織細胞類型。

在篩選高鑒別能力標記的同時，還需建立適合法醫(yī)學檢材特點、足夠便捷、能與當代DNA分析技術(shù)相匹配的檢測方法。常用的應用性MVP分析技術(shù)大多操作繁瑣、耗時費力，難以達到自動化、標準化的要求[9-10]。本研究旨在把常用的FastDigest內(nèi)切酶[11]、鏈融解曲線分析（melting curve analysis，MCA）[12-13]與傳統(tǒng)的甲基化敏感性限制酶PCR（methylation-sensitive restriction enzyme PCR，MSRE-PCR）技術(shù)[14-15]結(jié)合起來，建立一種能在單管內(nèi)連續(xù)進行酶切、擴增和MCA檢測的簡便方法——單管消化后PCR鏈融解曲線分析（post-digestion PCR-melting curve analysis，PDPMCA）技術(shù)，以期實現(xiàn)多個MVP的單管、閉管、復合、快速檢測，為DNA甲基化標記在法醫(yī)學中的應用尋求合適的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀（德國QIAGEN公司），F(xiàn)LA6000微量紫外可見分光光度計（杭州晶飛科技有限公司），TGL-16B高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

限制酶FastDigest?HhaⅠ、FastDigest?HpaⅡ、普通HhaⅠ、普通HpaⅡ和熱啟動Taq DNA聚合酶（加拿大Fermentas公司），20×Eva Green熒光染料（美國Biotium公司），甜菜堿、二甲基亞砜（美國Sigma公司）。

1.2 樣品

按知情同意原則收集健康成人外周靜脈血、精液、陰道液各5份。常規(guī)的蛋白酶K消化、酚-氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度法定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

根據(jù)文獻[16-19]報道的DMR為模型，從Genebank中獲取4個具有組織特異性的差異甲基化序列MAGE-1、14-3-3σ、MCJ、TIMP，用pDRAW32軟件搜索其中可為限制酶FastDigest?HhaⅠ和HpaⅡ識別的MVP數(shù)。運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，使擴增片段內(nèi)至少有1個MVP，4個片段的解鏈溫度（melting temperature，Tm）梯度增加。另外設(shè)置一個擴增參照片段AC，不含HhaⅠ和HpaⅡ識別的MVP，且Tm低于上述4個片段（表1）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 擴增片段與引物信息

1.4 多重PCR-MCA確定引物組合

常規(guī)PCR法確定各基因座最佳的引物濃度、反應體系和循環(huán)參數(shù)。在此基礎(chǔ)上進行組合、優(yōu)化，形成兩套復合擴增體系（A組合為AC、MAGE-1、14-3-3σ 和MCJ，B組合為AC、MAGE-1、MCJ和TIMP），分別檢驗其復合擴增后直接進行多重MCA檢測的可行性。

反應體系20μL：含熱啟動Taq DNA聚合酶1.5U，引物組合A或B（濃度見表1），2×通用反應液10 μL（含緩沖離子、MgCl2、dNTPs、EvaGreen、甜菜堿和二甲基亞砜等），20 ng外周靜脈血基因組DNA，加純水至20 μL。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀上順次進行擴增和MCA分析。

循環(huán)參數(shù)：94℃8min；94℃30s，59℃25s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃5min。MCA分析：從70℃開始，逐步升高溫度至94℃，每步上升0.2℃，Green/HRM通道采集熒光信號。

保持上述條件不變，分別以源于其他個體的DNA和各種濃度的DNA（0.5～80 ng）為模板重復實驗，檢驗方法的穩(wěn)定性、靈敏度。

1.5 單管PDP-MCA法

反應體系20μL：含F(xiàn)astDigest?HhaⅠ和HpaⅡ各1 μL，引物組合（選擇1.4項中適用于單管PDPMCA技術(shù)的引物組合），待測樣品基因組DNA 20ng，Taq DNA聚合酶和通用反應液同1.4項，加純水至20μL。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM熒光定量PCR儀上順次進行酶切、擴增和MCA分析。

循環(huán)參數(shù)：37℃保溫10 min，后續(xù)步驟和重復管設(shè)置同1.4項。每批反應設(shè)置假酶切對照管（不加限制酶），以外周靜脈血基因組DNA為模板，用50%甘油2μL代替限制酶，其余條件與酶切管完全相同。

保持上述條件不變，以各濃度外周靜脈血基因組DNA（0.5～80ng）為模板重復實驗，測試方法的靈敏度。

1.6 傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法

按照產(chǎn)品說明書，基因組DNA用普通HhaⅠ、普通HpaⅡ酶切8 h，取相當于20 ng基因組DNA的酶切物進行復合擴增和MCA分析。除不含限制酶、略去37℃保溫步驟外，PCR體系和循環(huán)參數(shù)同1.5項。

1.7 數(shù)據(jù)分析

Rotor-Gene 2.0.2.4軟件分析數(shù)據(jù)生成MCA圖譜，用Origin8的Peak Analyzer模塊進行基線扣除和峰積分計算，Statistics模塊進行峰參數(shù)的統(tǒng)計學描述和配對t檢驗。比較兩種方法所得基因片段的峰面積占MCA曲線下總面積的百分比。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR-MCA圖譜

以外周靜脈血基因組DNA為模板，經(jīng)調(diào)整引物濃度，優(yōu)化反應體系和循環(huán)參數(shù)，表1中的基因座均可以實現(xiàn)特異擴增（圖1A、1B），并且可以分成A、B兩個組合進行復合擴增（圖1C、1D）。

A組合4個片段（AC、MAGE-1、14-3-3σ和MCJ）分管同步擴增時，MCA圖譜均呈單一的主峰，且片段之間的MCA峰主體上互不重疊（圖1A）；單管復合擴增時，MCA圖譜呈4個分離良好的峰，與4個片段相對應（圖1C）。以源于不同個體的基因組DNA重復測定，只要模板量在1～40 ng，各片段的峰位置偏離在0.2℃以內(nèi)，小于相鄰峰間距的1/10。

B組合（AC、MAGE-1、MCJ和TIMP）中MCJ和TIMP的MCA峰相互交疊（圖1B）；單管復合擴增時，與二者相應的峰呈雙頭寬峰或肩峰狀，且TIMP的MCA峰較分管同步擴增時右移0.5℃以上（圖1D）。故B組合不適用于單管PDP-MCA技術(shù)。

2.2 單管PDP-MCA法的建立

圖1 Tm差異片段的多重PCR-MCA圖譜

以2.1項多重PCR-MCA檢測為基礎(chǔ)，在反應體系內(nèi)引入FastDigest?HhaⅠ、FastDigest?HpaⅡ、引物A組合、啟動擴增前增加一個37℃保溫10min的酶切步驟，即為單管PDP-MCA法。用該技術(shù)檢測并生成精液、血液和陰道液各有其特異的MCA圖譜。與未加限制酶的假酶切對照管相比較，組成樣品MCA圖譜的各MVP峰的位置不變，但峰高、峰面積呈組織特異性變化（圖2）。這種變化與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法得到的結(jié)果一致（表2），精液的MAGE-1和14-3-3σ甲基化程度低于血液和陰道液，而陰道液的MCJ甲基化程度高于精液和血液，血液、精液樣品的MCJ峰高均小于0.1（圖2）。除14-3-3σ基因座外，各樣品用兩種方法的檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。當前實驗條件下，1 ng的基因組DNA可獲得穩(wěn)定的MCA圖譜。加入的基因組DNA 在1～40ng，不影響圖譜的特異性。

在可進行高分辨率融解曲線（high resolution melting，HRM）的儀器上，用HRM模式進行MCA分析，除生成MCA圖譜外，得到的數(shù)據(jù)還可以用儀器配備的HRM軟件處理，得到標準和差異HRM圖譜，便于比較樣品間的差異（圖3）。

圖2 不同組織來源樣品的單管PDP-MCA圖譜

表2 單管PDP-MCA法與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法結(jié)果比較（n=5，±s，%）

表2 單管PDP-MCA法與傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法結(jié)果比較（n=5，±s，%）

注：表中數(shù)值為各基因片段的峰面積占MCA曲線下總面積的百分數(shù)

MCAPDP-MCAMSRE-PCR MCA對照15.67±2.3014.79±1.1018.40±1.4519.90±0.6044.56±1.6944.53±0.6018.51±1.4317.14±0.99血液25.72±1.4524.14±1.7526.07±0.6126.57±4.5943.21±2.4943.12±2.510.67±0.401.01±0.55精液42.59±1.6941.52±2.3417.11±1.6818.19±1.8334.65±3.6631.20±1.311.44±0.623.55±0.73陰道液19.23±1.8221.60±0.9326.57±1.6227.65±2.8243.41±3.1638.82±0.625.44±1.476.32±0.78樣品ACMAGE-114-3-3σMCJ PDP-MCAMSRE-PCR MCAPDP-MCAMSRE-PCR MCAPDP-MCAMSRE-PCR

圖3 樣品特異性的HRM圖譜

3 討論

3.1 原理

FastDigest內(nèi)切酶是一種新型的限制酶，具有高效、快速、模板和體系適應性強等優(yōu)點，在PCR緩沖體系內(nèi)也可以實現(xiàn)靶位點的有效切割[11]。直接把這種限制酶加入PCR體系，只需在常規(guī)擴增前37℃保溫10min，即可替代傳統(tǒng)的酶切步驟。實現(xiàn)酶切和擴增兩個反應在同一體系、同一管內(nèi)的連續(xù)進行。

MCA是一種根據(jù)融鏈曲線的特征來鑒別DNA片段的電泳替代技術(shù)。與根據(jù)長度差異性來分離檢測的電泳方法不同，MCA是一種基于解鏈溫度差異的均相閉管分析技術(shù)[13]。PCR體系內(nèi)如含有EvaGreen等雙鏈DNA熒光染料，在定量PCR儀上完成擴增后，只需在梯度升溫的同時采集熒光信號，就可得到特異性的MCA圖譜，即時提供靶片段的有無、產(chǎn)量及純度等類似電泳檢測的信息。復合擴增時，只要多個片段之間的解鏈溫度互不重疊，可以同時獲得各片段的信息并進行相互比較[12]。

同時采用FastDigest內(nèi)切酶和復合MCA技術(shù)，就可以把傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA的酶切、擴增和產(chǎn)物分析3個步驟集成于一個反應管內(nèi)，實現(xiàn)多個MVP的單步閉管快速檢測。

3.2 可行性

為了驗證上述原理或設(shè)計思路的可行性，本研究以文獻[16-19]報道的DMR為模型，成功建立了單管PDPMCA法。

從DMR中篩選含有MVP的可擴增片段，是建立該技術(shù)的前提。本研究運用兩種最常見的MSRE酶（HhaⅠ和HpaⅡ）設(shè)計并合成4個片段的引物（表1）進行實驗驗證，成功實現(xiàn)了運用引物A組合4個片段的單管PDP-MCA檢測。綜合上述序列分析和實驗驗證的結(jié)果，應用MSRE-PCR MCA法來進行MVP分析是可行的。同時，考慮到還有多種可用的MSRE酶及引物改進的可能性，多數(shù)DMR都可以找到符合設(shè)計要求的MVP，即該技術(shù)具有一定的實際應用前景。

FastDigest內(nèi)切酶的應用是本研究的另一重要改進。為了驗證其在PCR體系內(nèi)的切割效果，本研究比較了單管PDP-MCA法和傳統(tǒng)MSRE-PCR MCA法對同一組基因組樣品的檢測結(jié)果。兩種方法的MCA圖譜及峰積分數(shù)據(jù)（表2）均有良好的一致性，所反映的組織細胞甲基化特征也與文獻[16-19]報道相同。

只有在14-3-3σ基因座上，兩種方法的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可能系陰道液（樣本收集困難，檢材質(zhì)量偏低）DNA樣品的純度較低所致，有待進一步分析確認。改進后的方法總體上可以達到傳統(tǒng)的檢測效果，實現(xiàn)MVP的簡便快速分析，用于組織細胞之間甲基化差異的比較（圖2～3）。

應用本研究建立的單管PDP-MCA技術(shù)進行檢測，血液、精液和陰道液各有其特征性的圖譜（圖2～3），說明本技術(shù)具有解決法醫(yī)學斑痕類型鑒別等實際問題的潛力。本課題組正在對更多的斑痕特異性MVP進行優(yōu)選組合，以期建立一種符合法醫(yī)學應用要求的斑痕單管PDP-MCA鑒別技術(shù)。

3.3 優(yōu)勢與問題

與傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA法及其他基于DNA修飾的甲基化分析方法相比較，單管PDP-MCA技術(shù)的突出優(yōu)勢是簡便快速。該技術(shù)只需配制一次反應體系即可實現(xiàn)DNA樣品的甲基化分析，不需反復移液、換管及電泳操作，結(jié)束后可直接得到多種數(shù)字化的圖譜和相應的數(shù)據(jù)。在大幅降低操作量的同時，也降低了出錯和污染的機會，并使整個檢測過程有可能實現(xiàn)自動化和標準化。同時，檢測時間大為縮短。

當然，要作為一種實用的方法，單管PDP-MCA法在諸多方面尚需繼續(xù)完善優(yōu)化。首先，受可利用溫度范圍的限制，即使采用分辨率高的HRM技術(shù)，單色熒光MCA檢測可以復合的片段數(shù)目理論上很難超過10個。有必要繼續(xù)探討利用各種熒光探針或探針染料組合的多色MCA技術(shù)，以增加單次檢測的信息量[20]。其次，單管PDP-MCA的反應體系要兼顧酶切、擴增和熒光MCA檢測3個方面的要求，應繼續(xù)探討優(yōu)化各緩沖組分及反應組分的類型和濃度，引入對酶切效果進行控制的片段，以確立真正高效、靈敏、可靠的實用性方案。

需要指出的是，單管PDP-MCA法進行的是復合擴增、復合MCA和終點檢測，MCA峰與相應MVP的甲基化水平之間有相關(guān)性，但并非定量關(guān)系。樣品MCA圖譜的特異性是由所檢測的MVP共同決定的，其特征體現(xiàn)在圖譜內(nèi)各MVP峰之間的比例關(guān)系。未經(jīng)標準化的參數(shù)，在樣品間并沒有可比性。因此，在設(shè)置反應時，須使用熱啟動聚合酶，并注意控制PCR循環(huán)次數(shù)，防止引物二聚體等非特異性產(chǎn)物的形成，以保持MVP片段的融鏈峰與其甲基化水平之間的相關(guān)性。

在分析利用數(shù)據(jù)，對樣品圖譜的特征進行數(shù)字化描述或建立判別標準時，對于MCA圖譜，可以采用峰高比、峰面積比、峰面積百分比等，適用于沒有HRM功能的定量PCR儀，須借助其他軟件對MCA數(shù)據(jù)作進一步處理。在有HRM功能的定量PCR儀上，可用HRM代替MCA，直接得到標準和差異HRM圖譜，既直觀呈現(xiàn)樣品間的差異（圖3），又可直接以若干特征溫度點的標準熒光信號值為參量進行判別分析。

本研究用FastDigest內(nèi)切酶和MCA技術(shù)對傳統(tǒng)的MSRE-PCR MCA法進行改良，初步建立了一種簡便、快速、易于自動化和標準化的DNA甲基化分析技術(shù)。對于DNA樣品，該技術(shù)可以在2 h內(nèi)完成多個MVP的綜合評估，即時生成樣品特異性的MCA-HRM圖譜。適用于各種根據(jù)DNA甲基化差異對樣品進行歸類或鑒別的研究與應用。

[1]Rakyan VK，Down TA，Balding DJ，et al.Epigenomewide association studies for common human diseases[J]. Nat Rev Genet，2011，12（8）：529-541.

[2]趙書民，張素華，陳金中，等.同卵雙生子外周血DNA甲基化譜的差異[J].法醫(yī)學雜志，2011，27（4）：260-264.

[3]Bocklandt S，Lin W，Sehl ME，et al.Epigenetic predictor of age[J].PLoS One，2011，6（6）：e14821.

[4]Lee HY，Park MJ，Choi A，et al.Potential forensic application of DNA methylation profiling to body fluid identification[J].Int J Legal Med，2012，126（1）：55-62.

[5]Frumkin D，Wasserstrom A，Davidson A，et al.Authentication of forensic DNA samples[J].Forensic Sci Int Genet，2010，4（2）：95-103.

[6]Zhao G，Yang Q，Huang D，et al.Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J].Forensic Sci Int，2005，154（2-3）：122-127.

[7]王正，葉懿，侯一平.表觀遺傳學在法醫(yī)學應用探討[J].中國法醫(yī)學雜志，2011，26（1）：36-38.

[8]關(guān)亞卿，李淑瑾，叢斌，等.DNA甲基化在法醫(yī)DNA分析中的應用[J].中國法醫(yī)學雜志，2011，26（5）：380-382，386.

[9]Harrison A，Parle-McDermott A.DNA methylation：a timeline of methods and applications[J].Front Genet，2011，2：74.

[10]趙書民，李成濤.DNA甲基化在法醫(yī)學中的應用前景及其檢測方法新進展[J].法醫(yī)學雜志，2009，25（4）：290-295.

[11]von Kanel T，Gerber D，Schaller A，et al.Quantitative 1-step DNA methylation analysis with native genomic DNA as template[J].Clin Chem，2010，56（7）：1098-1106.

[12]Seipp MT，Pattison D，Durtschi JD，et al.Quadruplex genotyping of F5，F(xiàn)2，and MTHFR variants in a single closed tube byhigh-resolution amplicon melting[J].Clin Chem，2008，54（1）：108-115.

[13]Vossen RH，Aten E，Roos A，et al.High-resolution melting analysis（HRMA）：more than just sequence variant screening[J].Hum Mutat，2009，30（6）：860-866.

[14]Singer-Sam J，Grant M，LeBon JM，et al.Use of a HpaⅡ-polymerase chain reaction assay to study DNA methylation in the Pgk-1 CpG island of mouse embryos at the time of X-chromosome inactivation[J]. Mol Cell Biol，1990，10（9）：4987-4989.

[15]Melnikov AA，Gartenhaus RB，Levenson AS，et al. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation[J].Nucleic Acids Res，2005，33（10）：e93.

[16]Strathdee G，Sim A，Brown R.Control of gene expression by CpG island methylation in normal cells[J]. Biochem Soc Trans，2004，32（Pt 6）：913-915.

[17]De Smet C，Lurquin C，Lethé B，et al.DNA methylation is the primary silencing mechanism for a set of germ line-and tumor-specific genes with a CpG-rich promoter[J].Mol Cell Biol，1999，19（11）：7327-7335.

[18]Strathdee G，Davies BR，Vass JK，et al.Cell typespecific methylation of an intronic CpG island controls expression of the MCJ gene[J].Carcinogenesis，2004，25（5）：693-701.

[19]Oshiro MM，F(xiàn)utscher BW，Lisberg A，et al.Epigenetic regulation of the cell type-specific gene 14-3-3sigma[J].Neoplasia，2005，7（9）：799-808.

[20]Juskowiak B.Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential[J].Anal Bioanal Chem，2011，399（9）：3157-3176.

One-step Methylation Variable Position Analysis Technology in Single-tube

YUE Yang-yang1,2,ZHAO Gui-sen1,2,ZHANG Qian1,LU Di2,ZHAI Xian-dun1,MO Yao-nan1
（1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Key Laboratory of Evidence Science,China University of Political Science and Law,Ministry of Education,Beijing 100088,China）

ObjectiveTo develop the single-tube one-step methylation variable position（MVP）analysis technology——single-tube post-digestion PCR-melting curve analysis（PDP-MCA）.MethodsBased on differentially methylated region（DMR）reported previously as the model,a set of primers with different melting temperatures of products in the two sides of MVP were designed.By using the FastDigest methylation-sensitive restriction enzyme（MSRE）,DNA digestion,multiplex amplification,MCA detection and MCA profiles were performed in a single reaction tube.Same samples（peripheral venous blood,semen, and vaginal fluid,5 samples each type）were tested by single-tube one step MVP and traditional MSREPCR MCA technology.To verify the feasibility of this method,the results were compared with that of the traditional technology.The MCA/HRM profiles of different samples were analyzed and compared.ResultsWhen the melting temperature of the fragments had a differential of 2℃,the MCA melting peaks separated well,and MCA detection after multiplex amplification was successful.The single-tube PDP-MCA assay was developed,which integrated multiple reactions（digestion,amplification and detection）into one tube.By this method,the sample-specific profiles and data were analyzed in 2h,which is similar to that of the traditional method.The rapid classifications of the samples were also realized.ConclusionMultiplex MVPs can be analyzed in a single closed-tube.The single-tube PDP-MCA technology is a simple,fast,and automatable method.It can be used for detection of DNA methylation variations.

forensic genetics;DNA methylation;melting curve;methylation-sensitive restriction enzyme; methylation variable position

DF795.2

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.06.005

1004-5619（2013）06-0419-06

2012-04-26）

（本文編輯：柳燕）

《法醫(yī)學雜志》常用主題詞（六）

檢索詞主題詞英文串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法tandem mass spectrometry氣相色譜-質(zhì)譜法/氣液體色譜法-質(zhì)量光譜測定法/色譜法，氣液質(zhì)量光譜測定法/色譜法，氣質(zhì)量光譜測定法/質(zhì)量光譜測定法-氣相色譜法氣相色譜-質(zhì)譜法gas chromatography-mass spectrometry氣相色譜法色譜法，氣相chromatography，gas色譜法，高速液相/色譜法，高效液相/色譜法，高壓液相色譜法，高壓液相chromatography，high pressure liquid色譜法，液相/液相色譜法色譜法，液相chromatography，liquid間質(zhì)性肺疾病/肺炎，間質(zhì)性/肺炎，間質(zhì)肺疾病，間質(zhì)性lung diseases，interstitial肺疾病，阻塞性肺疾病，阻塞性lung diseases，obstructive慢性阻塞性肺疾病/慢性阻塞肺疾病肺疾病，慢性阻塞性pulmonary disease，chronic obstructive創(chuàng)傷性膈疝疝，橫膈，創(chuàng)傷性hernia，diaphragmatic，traumatic膈疝疝，橫膈hernia，diaphragmatic腹內(nèi)疝疝，腹部hernia，abdominal動脈瘤樣骨囊腫骨囊腫，動脈瘤樣bone cysts，aneurysmal胃癌胃腫瘤stomach neoplasms骨髓移植/骨髓細胞移植/移植，骨髓/移植，骨髓細胞/移植術(shù)，骨髓骨髓移植bone marrow transplantation

證據(jù)科學教育部重點實驗室（中國政法大學）開放基金資助項目（08KFKT002）

岳陽陽（1988—），男，陜西興平人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)分子遺傳學研究

趙貴森，男，副教授，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：lyfy@haust.edu.cn