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    葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停模式低氧大鼠海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表達(dá)的影響

    2013-03-11 08:19:54趙雅寧劉文倩王紅陽景麗偉
    關(guān)鍵詞:葡萄籽花青素低氧

    趙雅寧,劉文倩,王紅陽,竇 娜,郭 霞,景麗偉

    原花青素是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱,屬于植物多酚類物質(zhì),以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)、降血脂、抗腫瘤等功能[1~4]。目前有關(guān)葡萄籽原花青素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用研究較少。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep ap1nea-hypopnea syndrome,OSAHS)因睡眠過程反復(fù)發(fā)生的低氧/再復(fù)氧,可造成心、腦、腎等重要器官的損傷[5,6]。臨床上OSAHS患者表現(xiàn)警覺、執(zhí)行能力和運動協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知障礙,且與血管性癡呆的形成密切相關(guān)[6]。本研究采用在睡眠呼吸暫停模式慢性間歇性缺氧模型,探討葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停模式低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬區(qū)磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和白介素-1β(IL-1β)表達(dá)的影響,為中藥的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物、試劑及儀器 雄性SD 大鼠80只(北京維通利華公司,合格證SCXK(京)2002-003),體質(zhì)量310~350g;H-7650 透射電鏡(日本日立公司);測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠);低氧控制程序(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科);純氮(天津六方氣體高科技有限公司);低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué)研制)。

    1.2 動物分組和模型制備 80 只雄性SD 大鼠隨機分成對照組、模型組及高、低劑量葡萄籽原花青素干預(yù)組,各組動物20 只。模型組:模擬臨床臨床呼吸暫停事件,建立OSAHS 模式間歇低氧動物模型:每天8:00Am~4:00Pm 將實驗動物置于模型艙內(nèi),向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣和空氣,每組每次循環(huán)2min,連續(xù)給予氮氣30s,維持艙內(nèi)氧濃度最低至5%(50ml/L),隨后均復(fù)氧至氧濃度21%(210ml/L)。對照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度變化,使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi),使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內(nèi);每天實驗8h,實驗持續(xù)時間為2 和6w。干預(yù)組在動物進(jìn)入低氧模型艙前2w 開始每天灌胃給藥1 次,持續(xù)給藥8w,劑量分別為:高GSP200mg/kg、低100mg/kg。分別在實驗2w 和6w 進(jìn)行所設(shè)指標(biāo)檢測。

    1.3 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(電鏡)常規(guī)麻醉動物,開胸、暴露心臟,用混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流,斷頭取腦,取大腦海馬組織,切成1mm×1mm×1mm 組織塊,立即以40ml/L 戊二醛固定,0.1mol/L 二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍,再經(jīng)40ml/L 四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級丙酮脫水,環(huán)氧樹脂浸透,包埋,超薄切片,醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色,透射電鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)并攝片。

    1.4 磷酸化P38MAPK 和IL-1β 蛋白質(zhì)印跡檢測 大鼠致死后,迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織,稱量0.6g,4℃PBS 充分洗滌,加入3 倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液,冰浴中勻漿,4℃離心5min,12000 r/min,取上清。考馬斯亮藍(lán)(南京建成生物有限公司)法測各樣本的蛋白含量,樣本貯存于-80℃?zhèn)溆?。檢測步驟:蛋白樣品40μg 與等體積上樣緩沖液混合,煮沸10min,100g/L 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,封閉液室溫下震蕩2~3h,加入抗體(美國Cell Signaling 公司,磷酸化P38MAPK和IL-1β 濃度均為1∶2000),4℃孵育過夜,TBST 洗膜,標(biāo)記的二抗,37℃孵育1h,TBST 洗膜,ECL 顯色,用圖像分析儀測定光密度,作定量分析。

    1.5 學(xué)習(xí)記憶功能檢測 按照Smith 等[7]的方法,采用Morris 水迷宮進(jìn)行檢測。每只動物晨起訓(xùn)練5 次后分別在上午、下午各測試6 次,分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間單位為秒(s);及撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數(shù),取檢測記錄的總均值。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,檢驗方法為組間分析采用析因設(shè)計資料的方差分析,組內(nèi)分析采用SNK-q 分析。數(shù)據(jù)以±s 表示,P<0.05 為有顯著性意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 對照組神經(jīng)細(xì)胞形狀規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,胞核形狀規(guī)則,核膜完整,染色質(zhì)均勻,電子透明度高。模型組細(xì)胞外形不規(guī)則,多數(shù)線粒體嵴斷裂、減少、甚至出現(xiàn)大量空泡、消失或難以辨認(rèn),染色質(zhì)聚集靠邊等;葡萄籽原花青素組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)減輕,高劑量組尤為明顯(見圖1~圖5)。

    2.2 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表達(dá)變化 免疫印跡法檢磷酸化p38MAPK 和IL-1β蛋白表達(dá)水平:以β-actin 校準(zhǔn)后的蛋白條帶IOD 值反映其蛋白水平。與對照組比較,模型組腦組織海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表達(dá)增高,且隨低氧時間時間的延長,磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平進(jìn)一步增高;與間模型組比較,葡萄籽原花青素可有效降低磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平,且在高劑量葡萄籽原花青素組減低更為顯著(見表1)。

    2.3 各組水迷宮檢測結(jié)果 與對照組相比,模型組動物的大鼠逃避潛伏期時間均延長、穿越原平臺位置的次數(shù)均減少;與模型組比較,葡萄籽原花青素組能顯著縮短大鼠逃避潛伏期時間、增加原平臺位置的次數(shù)(P<0.05)(見表2)。

    表1 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比較(±s)

    表1 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比較(±s)

    與對照組比較* P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與低劑量組比較▲P<0.05

    表2 各組動物水迷宮檢測結(jié)果的比較(±s)

    表2 各組動物水迷宮檢測結(jié)果的比較(±s)

    與對照組比較* P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與低劑量組比較▲P<0.05

    圖1 對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

    圖2 模型組2w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

    圖3 模型組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

    圖4 低劑量組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

    圖5 高劑量組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可減輕OSAHS 模式間歇性低氧大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)損傷,改善動物學(xué)習(xí)記憶功能,說明葡萄籽原花青素對OSAHS導(dǎo)致的神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用。OSAHS 特征性的低氧方式是慢性間歇低氧,這種缺氧-復(fù)氧方式對神經(jīng)的損傷現(xiàn)類似腦缺血/再灌注,產(chǎn)生大量的活性氧,引起腦內(nèi)強烈氧化應(yīng)激,導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷,學(xué)習(xí)記憶受損[8],因此給予具有較強抗氧化、清除自由基作用的葡萄籽原花青素對OSAHS 誘導(dǎo)神經(jīng)損傷有較好保護(hù)作。譚毓治[9]曾報道葡萄籽原花青素能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,與其能降低血液和腦組織中過氧化脂質(zhì)有關(guān)。

    本研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可抑制OSAHS 模式間歇性低氧大鼠腦內(nèi)p38MAPK 的活性和炎癥因子IL-1β 的表達(dá)。p38MAPK 是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員,其活化對學(xué)習(xí)記憶的影響主要表現(xiàn)負(fù)性作用。研究顯示p38MAP 活化后經(jīng)多級激酶反應(yīng)介導(dǎo)凋亡基因或蛋白表達(dá),導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡,學(xué)習(xí)記憶損傷[10];此外,p38MAP 活化直接對海馬神經(jīng)突觸可塑性產(chǎn)生損傷,導(dǎo)致長時程增強(LTP)的受損從而致空間學(xué)習(xí)能力受損[11]。炎癥因子IL-1β 可通過核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κ B)激活巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞分泌粘附因子、IL-6、IL-8 等產(chǎn)生,促進(jìn)腦缺血缺氧后腦組織炎癥損傷的加劇,神經(jīng)功能受損。此外,IL-1β 可影響腦細(xì)胞對神經(jīng)活性物質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放和再攝取、調(diào)控輸入與輸出關(guān)系的反應(yīng)環(huán)路、影響突觸的可塑性和LTP 等,在認(rèn)知功能方面具有重要作用[12,13]。本研究中給予葡萄籽原花青素干預(yù)后,動物學(xué)習(xí)記憶明顯改善,同時二者表達(dá)水平呈劑量依賴式顯著下降,說明葡萄籽原花青素通過抑制p38MAPK 信號活化、減少IL-1β表達(dá)而改善OSAHS 模式低氧大鼠的認(rèn)知行為。

    總之,本實驗結(jié)果表明葡萄籽原花青素可以通過降低腦組織海馬區(qū)p38MAPK 信號活化、減少IL-1β 表達(dá),而改OSAHS 模式低氧導(dǎo)致的動物認(rèn)知功能損傷。葡萄籽原花青素具有多種藥理活性,其改善OSAHS 神經(jīng)損傷的其它機制有待進(jìn)一步探討。

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