新型全肝臟去細胞化流程對細胞外基質(zhì)及細胞組分殘留量影響的研究

汪 洋 劉 贊 葉海林 符竣惠 徐啟綱 曾其強 吳建波 張啟瑜*(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，溫州 35000)

2(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實驗室，溫州 325000)

引言

以往的研究表明，同種甚至異種的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)可對成體細胞的生長及干細胞的分化起重要作用［1］。不僅僅局限在皮膚［2］、膀胱［3］、心血管瓣膜［4］等組織，在組織工程應用中，以ECM 來源的去細胞化支架，于體外重建體積較大、較復雜的器官組織如肺［5］、心臟［6］等也已經(jīng)可以實現(xiàn)，但仍有如回填細胞來源缺乏，器官功能重建不完善等諸多問題［7］。其中之一就是細胞組分殘留與ECM 組分保護的矛盾問題。各類去細胞化技術(shù)在去除細胞的同時，對ECM 成分和結(jié)構(gòu)有著不同程度的損害，但在目前一些已經(jīng)臨床應用的去細胞化支架中，存在很多因去細胞不完全而讓患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫排斥及細胞毒性反應的事例。因此，建立一個完善的去細胞化效果評價體系十分重要［8-10］。在肝臟組織工程研究中，我們結(jié)合國內(nèi)外各種去細胞化方法，以大鼠肝臟為研究對象，采用一種新的全肝臟去細胞化流程來制作去細胞化支架，并檢測其形態(tài)結(jié)構(gòu)，ECM 各組分含量，供體細胞組分殘留量，完善評價其去細胞化效果。通過三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)與支架的結(jié)合，探討一種去細胞化支架在干細胞培養(yǎng)及肝臟疾病治療中的新的應用模式。

1 材料與方法

1.1 材料

成年Sprague Dawley 大鼠(體重250 ～350 g;中國科學院上海實驗動物中心);去細胞化試劑有胰蛋白酶(Gibco 公司，中國)、TritonX-100(Sigma 公司，中國)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA;Sigma 公司，中國)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS;Sigma 公司，中國)、苯甲基磺酰(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF;Sigma 公司，中國)、過氧乙酸(上?；瘜W試劑廠，中國)、乙醇(上?；瘜W試劑廠，中國)、青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco 公司，美國)、兩性霉素B(Sigma 公司，美國)、兔抗大鼠層粘連蛋白抗體(Bioworld 公司，美國)、兔抗大鼠I 型膠原蛋白抗體(Bioworld 公司，美國)、兔抗大鼠纖粘連蛋白抗體(Bioworld 公司，美國)、氨基聚糖檢測試劑盒(Biocolor 公司，英國)、大鼠肝細胞生長因子酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(hepatocyte growth factor，HGF;enzyme linked immunosorbent assay，ELISA;R＆D 公司，美國)、大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(vascular endothelial growth factor，VEGF;R＆D 公司，美國)、組織酸水解法羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)、組織DNA 抽提試劑盒(QIAGEN 公司，美國)、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 抗 體 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH;Bioworld 公司，美國)、兔抗大鼠高遷移率族蛋白1 抗體(high mobility group，box-1 protein，HMGB1;Santa cruz 公司，美國)、鼠抗鼠主要組織相容性復合體I 抗體(major histocompatibility complex I，MHC-I;Cell Signaling 公司，美國);細胞培養(yǎng)材料有DMEM(Gibco 公司，中國)、胎牛血清(Gibco 公司，古巴)，丁酸鈉(Sigma 公司，美國);山羊抗大鼠白蛋白抗體(Santa Cruz 公司，美國)。

所有關(guān)于實驗動物相關(guān)操作，均在溫州醫(yī)學院實驗動物倫理委員會監(jiān)督指導下進行。

1.2 方法

1.2.1 新型大鼠全肝臟去細胞化支架的制作

成年雄性SD 大鼠取腹部正中十字切口，暴露出肝下下腔靜脈和門脈系統(tǒng)區(qū)域并全身肝素化(肝素100 U/mL，1 ～2 mL)，標記腹腔干，結(jié)扎膽總管。切開膈肌，切斷食管、肝上及肝下下腔靜脈，門靜脈置8F 塑料管并雙重結(jié)扎固定，完整取下肝臟浸沒于0.1 mM PBS 液內(nèi)放置于-80℃下24 h 后室溫下解凍(物理法)。0.02% 胰酶/0.05% EDTA 溶液37℃下流速8 mL/min 灌洗肝臟2 h(酶學法)，后以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗15 min 洗去殘留胰酶。3% Triton-X100/0.05% EDTA/0.1% PMSF溶液灌洗肝臟16 ～18 h，以0.1% SDS 溶液再灌洗肝臟1 h(化學離子去污劑法)。此后以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗肝臟15 min，重復一次，接著再以去離子水和0.2 mM PBS 溶液各沖洗30 min(高低滲溶液法)洗去殘留的化學去污劑。0.01%過氧乙酸/4%乙醇溶液灌洗肝臟1 h(消毒及去除殘留DNA)，再以青霉素/鏈霉素/兩性霉素B 溶液灌洗肝臟24 h 以上。以上過程中流速均為室溫下8 mL/min，嚴格注意無菌操作。

1.2.2 組織形態(tài)學分析

1.2.2.1 大體組織形態(tài)學

分別觀察不同去細胞階段肝臟的大體形態(tài)，支架浸泡于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后H＆E 染色，光鏡下觀察組織的結(jié)構(gòu)，并與正常肝臟組織進行對比。

1.2.2.2 Ⅰ型膠原、層粘連蛋白、纖粘連蛋白的分布

去細胞支架及新鮮正常肝臟組織4%多聚甲醛固定，包埋切片，3% 牛血清蛋白封閉后，分批加入1:200 稀釋的兔抗大鼠層粘連蛋白抗體、兔抗大鼠I型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠纖粘連蛋白抗體室溫孵育2 h，滴加生物素化二抗(山羊抗兔)室溫孵育20 min，再滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，0.1 mM PBS 沖洗后加入DAB 顯色，光鏡下觀察I 型膠原蛋白、纖粘連蛋白及層粘連蛋白的分布及含量。

1.2.2.3 掃描電鏡檢測

去細胞化支架及正常肝臟組織經(jīng)過體積分數(shù)2.5%戊二醛固定，梯度酒精逐級脫水，置換，臨界點干燥后噴金，掃描電鏡觀察組織內(nèi)的血管及各種細微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 細胞外基質(zhì)成分含量檢測

1.2.3.1 氨基聚糖的檢測

采用氨基聚糖含量檢測試劑盒。分別稱取50～100 mg 新鮮肝臟組織和去細胞化支架，65℃木瓜蛋白酶消化3 h，設置空白對照、標準品及待測樣本，分別加入GAG 染料，常溫震蕩30 min 后12 000 r/min 離心10 min。干燥后加入解離劑，10 min 后酶標儀656 nm 波長下測吸光度值，計算標準曲線及組織內(nèi)GAG 的含量。

1.2.3.2 總膠原蛋白檢測

組織酸水解法羥脯氨酸測定試劑盒檢測。準確稱取25 ～50 mg 新鮮正常肝臟組織及去細胞化支架，加6 mol/L HCL 沸水浴水解5 h 后調(diào)pH 至6.0～6.8，離心取上清后，設置空白管、標準管，分別按順序加入試劑1、試劑2、試劑3，60℃水浴15 min 后離心，上清于550 nm 波長處測吸光度值。羥脯氨酸含量的計算公式為:

組織總膠原蛋白含量按羥脯氨酸的含量占總膠原蛋白含量的14%來估算。

1.2.3.3 細胞因子HGF 及VEGF 含量的檢測

大鼠HGF ELISA 試劑盒、大鼠VEGF ELISA 試劑盒檢測。分別稱取25 ～50 mg 新鮮肝臟組織和去細胞化支架，勻漿取上清，設置好空白對照、標準品、樣品組，按順序加入抗IGFBP-3 抗體、鏈霉親和素-HRP，37℃溫育60 min 后，洗板，加入顯色劑A、B，37℃避光孵育10 min 后加終止液，酶標儀450 nm波長測各孔吸光度值，計算標準曲線及對應的組織內(nèi)HGF 和VEGF 含量。

1.2.4 細胞組分殘留檢測

為正確評價新型去細胞化流程(n =5)在去除細胞殘留組分的效果，將其設為A 組，在與正常肝臟組織(n =5)C 組比較的同時，參照文獻［7］法制作的支架(n =8)作為B 組進行對比，觀察以下組分含量的大小。

1.2.4.1 DNA 殘留量檢測

組織DNA 抽提試劑盒檢測。分別稱取25 ～50 mg 的A、B、C 組組織，蛋白酶k 在55℃下消化組織3 h，具體步驟按試劑盒內(nèi)說明書要求操作，以酶標儀260 nm 波長處檢測抽提出樣本的DNA 吸光度值，組織DNA 的含量(μg/mg)按5 倍的吸光度值計算。

1.2.4.2 GAPDH、MHC-I 及HMGB1 蛋白殘留量的檢測

采用 Western-blotting 法，分別稱取25 ～50 mgA、B、C 組組織勻漿，提總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。為了比較單位組織內(nèi)各組間蛋白殘留量的差別，每孔統(tǒng)一稀釋至20 μg 組織所含蛋白后上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，孵一、二抗，曝光。Quantity One 軟件分析灰度值比較各蛋白殘留量大小。

1.2.5 與三維培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合誘導培養(yǎng)WBF-344細胞

去細胞后的支架連入自行設計組裝的三維雙腔循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，以分時多次法注入數(shù)目為107的WBF-344 卵圓細胞，含10% 胎牛血清及3.75 mmol/mL 丁酸鈉的DMEM 培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)，H＆E染色及白蛋白免疫熒光觀察細胞狀態(tài)。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

測量結(jié)果通過SPSS15.0 軟件包處理，實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用Student t 檢驗判斷兩個樣本均數(shù)之間有無差別，細胞組分殘留量的比較采用多樣本方差分析法，P ＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。

圖1 三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)(1 － 儲液氧合腔;2 － 支架灌流腔;3 －蠕動泵;4 －去氣泡裝置;5 －鼓泡式氧合口)Fig．1 Three dimensional perfusion culture system (1 －Reservoirs;2 － Perfusion chamber;3 － Peristaltic pump;4 － Bubble trapper;5 － Bubble oxygenator)

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學分析

2.1.1 大體組織學觀察

整個去細胞化過程共用時72 h，期間肝臟逐漸變白并透明化，內(nèi)部可見管脈系統(tǒng)完整。H＆E 染色結(jié)果顯示去細胞化后未見明顯供體細胞成分及DNA 殘留，血管網(wǎng)系統(tǒng)尚完整(見圖2)。

圖2 大體組織學觀察。(a)正常肝臟;(b)去細胞化完成后肝臟;(c)正常肝臟組織H＆E 染色(200 ×);(d)去細胞化支架H＆E 染色(200×，* :門靜脈)Fig． 2 Morphological and histological observation． (a ) Normal liver; (b )Decellularized liver;(c)Hematoxylin and eosin staining of normal liver (200 × );(d )Hematoxylin and eosin staining of decellularized liver (200 ×，* :the portal vein)

2.1.2 I 型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白的分布

樣本經(jīng)免疫組化染色后，與正常組織比較，去細胞化支架內(nèi)仍保留有大量的I 型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白等細胞外基質(zhì)主要成分(見圖3)。

2.1.3 掃描電鏡檢測

掃描電鏡觀察顯示，在去除細胞后，未見明顯細胞殘留成分，細胞外基質(zhì)形態(tài)保持完好，三維結(jié)構(gòu)未遭破壞(見圖4)。

2.2 細胞外基質(zhì)成分含量檢測

2.2.1 氨基聚糖的檢測兩兩比較

對組織中GAG 含量的檢測結(jié)果顯示:正常組織的含量(79.88 ±3.48)μg/g，去細胞化支架組織的含量為(71.06 ±1.92)μg/g。與正常組織比較，P ＜0.05，在去細胞化后，GAG 有一定的損失(見圖5)。

2.2.2 總膠原蛋白含量檢測

通過檢測羥脯氨酸的含量，估算出總膠原蛋白含量為:正常組織(83.76 ± 6.37)μg/g，去細胞支架(87.45 ±4.46)μg/g。兩組數(shù)據(jù)比較，P ＞0.05，說明去細胞化過程未對總膠原蛋白含量有影響(見圖6)。

圖3 免疫組化結(jié)果(400 ×)。(a)正常肝臟組織I 型膠原蛋白;(b)去細胞化支架I 型膠原蛋白;(c)正常肝臟組織層粘連蛋白;(d)去細胞化支架層粘連蛋白;(e)正常肝臟組織纖粘連蛋白;(f)去細胞化支架纖粘連蛋白Fig． 3 The results of immunohistochemistry． (400 × )(a)Collagen I of normal liver;(b)Collagen I of decellularized liver;(c)Laminin of normal liver;(d)Laminin of decellularized liver;(e)Fibronectin of normal liver;(f)Fibronectin of decellularized liver

2.2.3 細胞因子HGF 及VEGF 含量的檢測

ELISA 法檢測結(jié)果為:正常組織含HGF (44.46±4.64)ng/g，VEGF (34.78 ±3.23)ng/g;去細胞化支架含HGF (19.68 ±1.49)ng/g，VEGF (13.44 ±1.94)ng/g。P ＜0.05，去細胞化支架內(nèi)仍保留有一定量的細胞因子HGF 和VEGF(見圖7)。

2.3 細胞組分殘留檢測

2.3.1 DNA 殘留量檢測

各組DNA 含量分別為A 組(新型去細胞化流程組):(0.66 ±0.15)μg/g;B 組(文獻［7］法組):(0.90 ±0.21)μg/g;C 組(正常組織組):(17.73 ±2.20)μg/g。與正常肝臟組織C 組比較，P ＜0.05，差別具有統(tǒng)計學意義，說明A、B 兩組去細胞方法均能達到目前公認對去細胞支架DNA 含量的要求。A、B 兩組間比較，P ＞0.05，差別不具備統(tǒng)計學意義，可見A、B 兩組去細胞化過程中對DNA 的去除效果相當(見圖8)。

2.3.2 GAPDH、MHC-I 及HMGB1 蛋白殘留量的檢測

Quantity One 軟件分析灰度值后各蛋白殘留量如圖9 所示，與C 組比較，P ＜0.05，A、B 兩組中GAPDH、MCH-I、HMGB-1 的殘留量都有所下降。同樣，A、B 兩組比較，P ＜0.05，表明相較B 組的去細胞流程，A 組能更完全的去除殘留的細胞組分。

2.4 三維培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合培養(yǎng)WBF －344 細胞

WBF-344 卵圓細胞注入培養(yǎng)系統(tǒng)后的第3 d 及第7 d，H＆E 染色和白蛋白免疫熒光顯示(見圖10)細胞生長狀況良好，能較好的貼附于支架上，白蛋白表達量隨著誘導培養(yǎng)時間的延長而提高。

3 討論和結(jié)論

近些年來，隨著國內(nèi)外對于使用酶學法、物理法、化學試劑、滲透壓法等不同去細胞方法處理不同組織過程的深入研究，證明了不同的去細胞化方法，以不同的流程組合處理同樣的組織其效果不盡相同。學界公認以DNA 殘留量為去細胞化是否成功的最低要求，一般支架內(nèi)DNA 含量應小于5 μg/g的上限，并且H＆E 染色觀察無明顯DNA 成分殘留，才能稱為完成去細胞化［11］。

圖4 掃描電鏡(1200 ×)。(a)正常肝臟組織;(b)去細胞化支架Fig． 4 The results of scanning electron microscope(1200 × )． (a)Normal liver;(b)Decellularized liver

圖5 GAG 含量Fig．5 GAG content

圖6 總膠原含量Fig．6 Total collagen content

圖7 ELISA 結(jié)果。(a)HGF 含量;(b)VEGF 含量Fig． 7 ELISA results． (a)HGF content;(b)VEGF content

肝臟作為一個體積較厚、含有大量細胞成分的復雜器官，其去細胞化一直是研究熱點。Uygun 等最早應用不同濃度梯度的SDS 經(jīng)血管灌洗，成功去除了肝臟細胞獲得了大鼠全肝臟支架，并進行了原代肝臟細胞回填培養(yǎng)，但去細胞化用時較長，達5 d，且SDS 做為一種離子型去污劑有著較好的去細胞化效果的同時，對ECM 結(jié)構(gòu)的破壞也相當大，其中GAG 的丟失達50%以上［12］。國內(nèi)胡鵬蘊等也同樣進行了以不同濃度SDS 處理為主的去細胞化支架制作，但未對支架做完善的評價［13］。此后Soto-Gutierrez 等提出了以濃度3%的TritonX-100 為主要方法的去細胞流程，結(jié)果表明TritonX-100 作為一種較溫和的非離子型去污劑在達到與SDS 相近的去細胞效果同時，也相應的減少了對ECM 的破壞，通過酶學、滲透壓等多種方法的合理結(jié)合，時間上更是大大縮短至3 d［14］，Baptista 等在以tritonX-100 為主的肝臟去細胞化處理后，其支架所含GAG 相比正常組幾乎沒有損失［15］。深入研究證明，對于去細胞化殘留物的評價上，單一的DNA 殘留量還是不夠的。B?er 等研究了規(guī)范化流程對馬頸動脈的去細胞化過程，在DNA 殘留量達到標準后，仍有大量的細胞殘留成分，如細胞質(zhì)、細胞膜、細胞器碎片等［8］。另外Keane 等對目前很多常見的臨床去細胞化支架產(chǎn)品的研究表明，很多產(chǎn)品由于未去除殘留細胞組分而導致嚴重的巨噬細胞吞噬反應［10］。因此，一個完善的去細胞化效果評價是此類技術(shù)能否成功應用于臨床實踐的關(guān)鍵。

圖8 DNA 含量Fig．8 DNA content

圖9 細胞組分殘留量。(a)WB 條帶;(b)GAPDH含量;(c)MCH-I 含量;(d)HMGB-1 含量Fig．9 The residual content of cell components． (a)WB band pattern;(b)GAPDH content;(c)MCH-I content;(d)HMGB-1 content

本研究在去細胞化流程設計上，通過結(jié)合與改進Uygun 等及Soto-Gutierrez 等兩種不同的大鼠全肝臟去細胞化流程，以溫和的非離子型去污劑TritonX-100 為主要方法，減少對ECM 的破壞。在去細胞過程前期加入蛋白酶抑制劑PMSF，減少蛋白的降解;在后期輔助以去細胞能力較強的離子型去污劑SDS，以求能完全去除細胞殘留成分。SDS 的濃度控制在0.1%，既能較好的發(fā)揮其解離洗脫蛋白的作用，也不會對ECM 造成嚴重破壞。評價體系上我們從細胞外基質(zhì)組分和供體細胞組分殘留兩個角度入手，結(jié)果顯示:與正常組織比較，新型去細胞化流程制作出來的支架內(nèi)滿足DNA 殘留量的要求，保留了血管網(wǎng)等三維支架組織，膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白等ECM 主要成分在支架內(nèi)豐富存在，它們與部分保存住了的細胞因子HGF 和VEGF 一起能更好的模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境，有利于細胞的生長和干細胞的分化。結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，Soto-Gutierrez 等的流程在達到DNA 殘留量的標準的同時，仍有部分細胞組分如GAPDH、HMGB-1、MCH-I 殘留。GAPDH 作為細胞內(nèi)部恒量表達的蛋白，其殘留量對細胞骨架蛋白總殘留有著很好的代表性。HMGB -1 作為細胞生長的毒性物質(zhì)，其存在對細胞生長有著很大的影響［16］。而MCH-I 作為免疫排斥反應的主要激動蛋白，為了滿足移植的需求，同樣不應在支架內(nèi)殘留。本研究開發(fā)出的新型去細胞化流程雖然可能在加入SDS 后導致GAG 含量上減少了20%左右，但幾乎完全消除了以上供體細胞殘留的蛋白，在保護基質(zhì)與去除細胞殘留物的矛盾中尋找到了平衡點，評價體系較之此前的工作更加完善與科學。

圖10 WBF-344 細胞誘導培養(yǎng)結(jié)果。(a)和(b):培養(yǎng)第3 d 和第7 d 細胞H＆E 染色(400 ×);(c)和(d):培養(yǎng)第3 d 和第7 d 細胞白蛋白免疫熒光檢測(800 ×)Fig．10 WBF-344 cells induced culture results．(a)＆(b):H＆E staining in day 3 and day 7(400 ×);(c)＆(d):The immunofluorescence of albumin in day 3 and day 7(800 ×)

此外，本研究中設計的三維循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)的特點是生物反應器與去細胞支架結(jié)合，提出“雙腔”培養(yǎng)概念。內(nèi)腔容積小，用于盛放支架及制造灌流循環(huán);外腔容積大，用于氧合、酸堿度維持及養(yǎng)分供給。此概念將傳統(tǒng)意義上的儲液池和生物反應器結(jié)合在一起，以內(nèi)腔壁上的細胞篩網(wǎng)口相通，防止內(nèi)腔游離的細胞流向外腔，從而提高了內(nèi)腔循環(huán)的細胞密度，利于細胞盡快貼附于支架上支架內(nèi)。誘導培養(yǎng)WBF -344 卵圓細胞的結(jié)果，在進一步證明本研究中去細胞化流程制作出來的支架功能良好的同時，也說明了在體外通過類似體內(nèi)環(huán)境的三維ECM 培養(yǎng)系統(tǒng)對干細胞進行分化擴增、大量獲得功能良好的肝細胞是可能的。

總之，外科手術(shù)移植目前仍是治療終末期肝病比如門脈高壓性肝硬化等的最常用手段，但肝源缺乏和免疫排斥反應仍然是制約肝移植發(fā)展的主要因素。通過對供體器官進行去細胞化而得到的天然ECM 支架，以患者自體干細胞為種子細胞進行重填培養(yǎng)并使之分化為目的細胞的技術(shù)，可以作為肝移植之外治療終末期肝病的新選擇之一，有著廣闊的應用前景。整個系統(tǒng)可與人工肝臟的概念結(jié)合，用于等待肝臟或者肝細胞移植患者的全身白蛋白的增加及替代病肝的解毒作用緩解門靜脈壓力等，并可培養(yǎng)患者用于自體移植的肝臟細胞。最終隨著其他相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，于體外形成新的器官，移植回病人體內(nèi)，以此來替代異體器官移植達到最終治療的目的。

［1］ Vorotnikova E，McIntosh D，Dewilde A，et al． Extracellular matrix-derived products modulate endothelial and progenitor cell migration and proliferation in vitro and stimulate regenerative healing in vivo［J］. Matrix Biology，2010，29(8):690 -700.

［2］ Chen RN，Ho HO，Tsai YT，et al． Process development of an acellular dermal matrix (ADM)for biomedical applications［J］.Biomaterials，2004，25(13):2679 -2686.

［3］ Bolland F，Korossis S，Wilshaw SP，et al． Development and characterisation of a full-thickness acellular porcine bladder matrix for tissue engineering［J］. Biomaterials，2007，28(6):1061 -1070.

［4］ Bader A，Schilling T，Teebken OE，et al． Tissue engineering of heart valves-human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves［J］. Eur J Cardiothorac Surg，1998，14(3):279 -284.

［5］ Petersen TH，Calle EA，Zhao L，et al． Tissue-Engineered Lungs for in vivo Implantation［J］. Science，2010，329(5991):538-541.

［6］ Ott HC，Matthiesen TS，Goh SK，et al． Perfusion-decellularized matrix:using nature's platform to engineer a bioartificial heart［J］. Nat Med，2008，14(2):213 -221.

［7］ Badylak SF，Weiss DJ，Caplan A，et al． Engineered whole organs and complex tissues ［J］. The Lancet，2012，379(9819):943 -952.

［8］ B ?er U，Lohrenz A，Klingenberg M，et al． The effect of detergent-based decellularization procedures on cellular proteins and immunogenicity in equine carotid artery grafts ［J］.Biomaterials，2011，32(36):9730 -9737.

［9］ Daly KA，Liu S，Agrawal V，et al． The host response to endotoxin-contaminated dermal matrix ［J］. Tissue Engineering Part A，2012，18(11 -12):1293 -1303.

［10］ Keane TJ，Londono R，Turner NJ，et al． Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response［J］. Biomaterials，2012，33(6):1771 -1781.

［11］ Crapo PM，Gilbert TW，Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes［J］. Biomaterials，2011，32(12):3233 -3243.

［12］ Uygun BE， Soto-Gutierrez A， Yagi H， et al． Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix ［J］.Nature Medicine，2010，16(7):814 -820.

［13］ 胡鵬蘊，程遠，汪艷，等. 去細胞化全肝生物支架循環(huán)灌注培養(yǎng)條件下體外細胞再植［J］. 中國組織工程研究，2012，16(18):3231 -3235.

［14］ Soto-Gutierrez A，Zhang L，Medberry C，et al． A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement［J］. Tissue Engineering Part C:Methods，2011，17(6):677 -686.

［15］ Baptista PM，Siddiqui MM，Lozier G，et al． The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid［J］. Hepatology，2011，53(2):604 -617.

［16］ Daly KA，Liu S，Agrawal V，et al． Damage associated molecular patterns within xenogeneic biologic scaffolds and their effects on host remodeling［J］. Biomaterials，2012，33(1):91 -101.