凍干保護(hù)劑和預(yù)凍結(jié)速率對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨壓縮楊氏模量的影響

孫慧君 胥 義 呂 婭

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093)

引言

關(guān)節(jié)軟骨能為關(guān)節(jié)活動(dòng)提供低摩擦、低磨損和吸收力學(xué)沖擊等重要功能。由于關(guān)節(jié)軟骨沒(méi)有血管、淋巴管提供營(yíng)養(yǎng)，其自身修復(fù)能力很差，所以一旦損傷后，常常引發(fā)各種關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量［1］。軟骨移植是修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的一種非?？煽康闹委熓侄危邢薜年P(guān)節(jié)軟骨供體來(lái)源及其保存問(wèn)題，一直是制約關(guān)節(jié)軟骨移植手術(shù)得以推廣的主要原因。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在探索關(guān)節(jié)軟骨的低溫保存技術(shù)［2-7］，期望能成功建立關(guān)節(jié)軟骨低溫保存組織庫(kù)，為臨床應(yīng)用提供豐富的材料來(lái)源，同時(shí)也便于醫(yī)生有足夠的時(shí)間進(jìn)行術(shù)前更準(zhǔn)確的尺寸和形狀匹配，以及充分的病毒學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)等工作［8］。但有研究發(fā)現(xiàn)，低溫冷凍軟骨移植后出現(xiàn)了軟骨組織纖維化、軟骨基質(zhì)斷裂以及機(jī)械力學(xué)性能顯著降低等問(wèn)題，這很可能是冷凍關(guān)節(jié)軟骨解凍過(guò)程中造成的結(jié)果［9-11］。與此同時(shí)，采用低溫保存的方法需要用到液氮，其相應(yīng)的設(shè)備和運(yùn)行成本較高。而冷凍干燥技術(shù)用于生物組織的保存具有如下優(yōu)越性［12］:一是制品在真空的環(huán)境下升華干燥后體積、形狀基本不變，呈海綿狀，無(wú)干縮，復(fù)水時(shí)能夠迅速還原成原來(lái)的性狀;二是能夠除去物料中90%以上的水分，能在常溫長(zhǎng)期保存，不需要昂貴的低溫儲(chǔ)存設(shè)備及復(fù)雜的保存條件;三是凍干后質(zhì)量很輕，方便長(zhǎng)途運(yùn)輸。

鑒于此，本研究采用冷凍干燥法來(lái)保存關(guān)節(jié)軟骨，探索凍干保護(hù)劑的種類、濃度以及預(yù)凍結(jié)速率等對(duì)冷凍干燥關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響，有助于深入認(rèn)識(shí)關(guān)節(jié)軟骨冷凍干燥保存過(guò)程中的生物力學(xué)性能保護(hù)情況。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1.1.1 動(dòng)態(tài)機(jī)械熱分析儀(DMA)實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)態(tài)機(jī)械熱分析儀為DMA-Q800(TA，美國(guó))。根據(jù)試驗(yàn)需要，采用靜態(tài)壓縮模式，預(yù)載荷為0.01 N，在37℃恒溫的環(huán)境下，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的關(guān)節(jié)軟骨樣品以2 N/min 的速率加載至17 N 即停止測(cè)試。在得出應(yīng)力應(yīng)變曲線后，由DMA 自動(dòng)處理數(shù)據(jù)得到楊氏模量。

1.1.2 程序降溫裝置

實(shí)驗(yàn)采用的程序降溫裝置為升降式程序降溫儀［13］，其工作原理是利用液氮容器中液氮蒸汽的縱向溫度梯度，用微機(jī)控制微電機(jī)的轉(zhuǎn)向和轉(zhuǎn)速，再通過(guò)牽引繩來(lái)調(diào)節(jié)樣品在液氮蒸汽中的位置，使樣品處于程序所設(shè)置的溫度(– 60℃)。本研究以1、10、20℃/min 等 3 種 預(yù) 凍 結(jié) 速 率 從 室 溫 降至-60℃。

1.1.3 Virtis 凍干機(jī)

實(shí)驗(yàn)采用的凍干機(jī)為Advantage 2.0(Virtis，USA)。根據(jù)試驗(yàn)要求，將預(yù)凍溫度設(shè)置在-60℃，恒溫1 h 后開(kāi)始升華干燥。將凍干機(jī)的擱板溫度設(shè)置在-50℃，真空度10 ～13 Pa，恒溫16 h 后開(kāi)始解析干燥。將凍干機(jī)的擱板溫度設(shè)置在-20℃，真空度10 ～13 Pa，恒溫4 h。再將凍干機(jī)的擱板溫度設(shè)置在0℃，真空度10 ～13 Pa，恒溫4 h。最后，將凍干機(jī)的擱板溫度設(shè)置在20℃，真空度10 ～13 Pa，恒溫2 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取上海本地成年豬，取整根有兩瓣半月板覆蓋的白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去，并用專用工具(沖頭)制備直徑為5 mm 的軟骨測(cè)試樣品。用格林氏液將樣品表面的滑液沖洗掉，先取出6 個(gè)樣品均分放置在兩個(gè)裝有PBS 溶液(pH =7.4)的容器中，再將其余取出的樣品分別置于體積濃度為10 %、20%、30%、40%、50%、60%、80%(V/V)的二甲基亞砜(DMSO)(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甘油(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)以及1，2-丙二醇(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以下簡(jiǎn)稱“丙二醇”)中進(jìn)行2.5 h 的充分滲透，使凍干保護(hù)劑和軟骨內(nèi)的水分充分置換。每個(gè)PBS 溶液中的樣品在進(jìn)行2.5 h 的充分滲透后(作為空白對(duì)照組)，可直接用于DMA 儀器測(cè)量。經(jīng)凍干保護(hù)劑充分滲透后，將樣品用程序降溫儀以1、10、20℃/min 等3 種不同的預(yù)凍結(jié)速率降溫至-60℃，再將樣品與放置在另外一個(gè)PBS 溶液中的樣本快速轉(zhuǎn)移到凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥好的樣品浸泡在PBS(pH =7.4)中1.5 h，復(fù)水后再用于DMA儀器測(cè)量。在預(yù)凍結(jié)速率相同的條件下，分析凍干保護(hù)劑的種類和濃度對(duì)凍干關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響。為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每一實(shí)驗(yàn)條件做3 個(gè)平行樣。文中的數(shù)據(jù)是以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”的形式給出的。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡觀察

將對(duì)照組和以1、20℃/min 預(yù)凍結(jié)速率冷凍到-60℃的樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察(放大倍數(shù)為500 000倍)，可以觀察到在圖1 對(duì)照組樣品的膠原纖維主要有粗細(xì)兩類，粗纖維由若干條細(xì)纖維聚集而成，多呈束帶狀或條索狀;粗細(xì)纖維相互編織，形成層次分明、立體的膠原網(wǎng)絡(luò)。圖2 是預(yù)凍結(jié)速率為1℃/min 凍干樣品的膠原纖維部分的斷裂現(xiàn)象，圖3 是預(yù)凍結(jié)速率為20℃/min 凍干樣品的膠原纖維的斷裂現(xiàn)象加劇。但是這些斷裂現(xiàn)象只是在冷凍過(guò)程中生成的冰晶刺破膠原纖維而造成的，對(duì)于生物力學(xué)研究的影響不大，即研究其楊氏模量在某種程度上來(lái)說(shuō)是有意義的。圖4 ～圖5 均為DMSO 40%處理過(guò)的樣品的掃描電鏡圖，可以看出在凍干保護(hù)劑的處理下，膠原纖維的破壞程度均有所降低，說(shuō)明對(duì)膠原纖維的結(jié)構(gòu)起到了一定程度的保護(hù)作用。

圖1 對(duì)照組樣品的掃描電鏡圖Fig．1 Control sample(SEM)

圖2 預(yù)凍結(jié)速率為1℃/min 樣品的掃描電鏡圖Fig．2 Sample treated with 1℃/min cooling rate(SEM)

圖3 預(yù)凍結(jié)速率為20℃/min 樣品的掃描電鏡圖Fig． 3 Sample treated with 20℃/min cooling rate (SEM)

圖4 預(yù)凍結(jié)速率為1℃/min DMSO40%處理樣品的掃描電鏡圖Fig． 4 Sample treated with DMSO40% (1℃/min)(SEM)

2.1 凍干保護(hù)劑的濃度對(duì)楊氏模量的影響

如圖6 所示，在預(yù)凍結(jié)速率為1、10 以及20℃/min 下，經(jīng)不同濃度DMSO 處理的凍干樣品的楊氏模量隨著濃度變化而變化?？梢钥闯?空白對(duì)照組的楊氏模量最大，添加凍干保護(hù)劑凍干樣品的楊氏模量次之，新鮮未加保護(hù)劑的凍干樣品的楊氏模量最小;當(dāng)DMSO 的濃度在小于40% (V/V)范圍內(nèi)，楊氏模量隨著濃度的增大而增大。例如，在預(yù)凍結(jié)速率均為1℃/min 時(shí)，添加10%(V/V)DMSO 凍干樣品的楊氏模量為1.423 MPa，40% (V/V)DMSO凍干樣品的楊氏模量為2.356 MPa，在大于40%(V/V)范圍內(nèi)楊氏模量隨著濃度的增大而減小。例如，預(yù)凍結(jié)速率為1℃/min 時(shí)，添加50% (V/V)DMSO 凍干樣品的楊氏模量為2.143 MPa，80%(V/V)DMSO 的凍干樣品的楊氏模量為1.93 1 MPa。

圖5 預(yù)凍結(jié)速率為20℃/min DMSO40%處理樣品的掃描電鏡圖Fig． 5 Sample treated DMSO40% (20℃/min)(SEM)

圖6 凍干保護(hù)劑濃度對(duì)楊氏模量的影響(DMSO)Fig．6 Effects of concentrations of DMSO on Young’s modulus

在預(yù)凍結(jié)速率為1℃/min 的情況下，經(jīng)不同濃度DMSO 處理的凍干樣品的楊氏模量影響的方差分析結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1 的方差分析結(jié)果，F(xiàn) ＞F0.05，即P≤0.01。由該表中的顯著性水平可見(jiàn)，濃度對(duì)凍干樣品的楊氏模量的影響是極其顯著的。

表1 凍干保護(hù)劑濃度對(duì)楊氏模量影響的方差分析(DMSO)(α=0.05)Tab．1 The analysis of variance of effects of concentrations of DMSO on Young’s modulus(α=0.05)

2.2 預(yù)凍結(jié)速率對(duì)楊氏模量的影響

如圖7 所示，經(jīng)10、40、80%(V/V)DMSO 處理后，預(yù)凍結(jié)速率為1、10 和20℃/min 時(shí)的凍干樣品的楊氏模量?？梢钥闯?經(jīng)中低濃度DMSO 處理過(guò)的樣品隨著預(yù)凍結(jié)速率的增大楊氏模量減小。

DMSO 的濃度為40%(V/V)，經(jīng)不同預(yù)凍結(jié)速率處理的凍干樣品的楊氏模量影響的方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表2 方差分析結(jié)果，F(xiàn) ＞F0.05，即P≤0.01。由該表中的顯著性水平可見(jiàn)，預(yù)凍結(jié)速率對(duì)凍干樣品的楊氏模量的影響是極其顯著的。

表2 預(yù)凍結(jié)速率對(duì)楊氏模量影響的方差分析(DMSO)(α=0.05)Tab．1 The analysis of variance of effects of cooling rates on Young’s modulus (with DMSO)(α=0.05)

圖7 預(yù)凍結(jié)速率對(duì)楊氏模量的影響(DMSO)Fig．7 Effects of cooling rates on Young’s modulus(with DMSO)

2.3 凍干保護(hù)劑種類對(duì)楊氏模量的影響

分別經(jīng)濃度為 10%、40%、80% (V/V)的DMSO、丙二醇、甘油處理，并經(jīng)過(guò)1、10、20℃/min 預(yù)凍結(jié)速率的處理凍干關(guān)節(jié)軟骨樣品的楊氏模量如圖8 所示?？梢钥闯?在中低濃度范圍內(nèi)，經(jīng)一定濃度的甘油、丙二醇處理，在相同的預(yù)凍結(jié)速率下，凍干樣品的楊氏模量隨著甘油、丙二醇濃度的增大而增大;在高濃度范圍內(nèi)，其楊氏模量隨著甘油、丙二醇濃度的增大而減小?？梢?jiàn)，這點(diǎn)和DMSO 在不同濃度下對(duì)凍干樣品的保護(hù)效果是一樣的。

在中低濃度范圍內(nèi)，在不同預(yù)凍結(jié)速率下，經(jīng)一定濃度的甘油、丙二醇處理，凍干樣品的楊氏模量隨著預(yù)凍結(jié)速率的增大而減小;在高濃度范圍內(nèi)，其楊氏模量隨著預(yù)凍結(jié)速率的增大而增大?？梢?jiàn)，這點(diǎn)和DMSO 在不同預(yù)凍結(jié)速率下對(duì)凍干樣品的保護(hù)效果是一樣的。

在中間濃度范圍內(nèi)，當(dāng)保護(hù)劑的濃度相同時(shí)，經(jīng)DMSO 處理的凍干樣品的楊氏模量最大，甘油的楊氏模量次之，丙二醇的楊氏模量最小;而在高濃度下，3 種保護(hù)劑的保護(hù)效果差不多。究其原因，主要是由3 種保護(hù)劑的官能團(tuán)決定的［22-23］。

圖8 不同溫度下不同凍干保護(hù)劑對(duì)楊氏模量的影響。(a)1℃/min (b)10℃/min (c)20℃/minFig．8 Effects of CPAs on Young’s modulus．(a)1℃/min(b)10℃/min(c)20℃/min

圖9 3 種凍干保護(hù)劑的分子式。(a)DMSO;(b)甘油;(c)1 －2 丙二醇Fig．9 Formula of the three CPA．(a)DMSO;(b)Glycerin;(c)Propylene glycol 1 －2

3 討論

從圖6 中可以看出，空白對(duì)照組的楊氏模量最大，添加凍干保護(hù)劑凍干樣品的楊氏模量次之，新鮮的未加保護(hù)劑凍干樣品的楊氏模量最小。當(dāng)DMSO 的濃度在小于40%(V/V)范圍內(nèi)，楊氏模量隨著濃度的增大而增大;在大于40% (V/V)范圍內(nèi)，楊氏模量隨著濃度的增大而減小。DMSO 作為凍干保護(hù)劑，屬于低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到了保護(hù)的目的。一般認(rèn)為，這些化合物中的官能團(tuán)(羥基)與水之間以氫鍵的形式鍵合，使得溶液變得黏稠，從而使水溶液中受擴(kuò)散制約的冰晶生長(zhǎng)變得緩慢，玻璃化形成趨勢(shì)增強(qiáng)，從而對(duì)膠原纖維的合理排列分布的破壞減少［14］。所以，添加凍干保護(hù)劑的樣品的楊氏模量大于新鮮的未加入保護(hù)劑凍干樣品的楊氏模量。但是，由于在冷凍干燥過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)力［15］，導(dǎo)致膠原纖維和蛋白多糖的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致凍干樣品的楊氏模量小于空白對(duì)照組的楊氏模量。課題組以前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DMSO 滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部時(shí)，高濃度的低溫保護(hù)劑可以將基質(zhì)內(nèi)部大量的分子替換成結(jié)合水，而低濃度的低溫保護(hù)劑只能將小部分水分子轉(zhuǎn)換成結(jié)合水，還有大部分水分子是自由水［16-17］。隨著DMSO 濃度的增加，溶液中的甲基和羥基的個(gè)數(shù)也會(huì)增加，結(jié)合水也越多，凍干保護(hù)劑在滲透過(guò)程中也置換了一部分在凍結(jié)時(shí)會(huì)產(chǎn)生相變的水的份額。所以在低濃度范圍內(nèi)隨著凍干保護(hù)劑濃度的增加，楊氏模量是逐漸增大的;在高濃度范圍內(nèi)，楊氏模量卻是減小的?？赡艿脑蚴?在高濃度范圍內(nèi)，軟骨樣品在本研究的預(yù)凍結(jié)溫度環(huán)境(-60℃)下并沒(méi)有處于凍結(jié)狀態(tài)。這個(gè)原因可以從文獻(xiàn)［13］等的研究中得到解釋:在溶質(zhì)濃度很低時(shí)，溶質(zhì)-溶劑之間的相互作用對(duì)整個(gè)溶液的影響很弱，溶液較多地表現(xiàn)出純水的性質(zhì);隨著濃度的升高，溶質(zhì)-溶劑的相互作用開(kāi)始加強(qiáng)，并開(kāi)始對(duì)過(guò)冷度產(chǎn)生明顯的影響。在高濃度區(qū)間，過(guò)冷度隨著濃度的增加而單調(diào)增加。Rios 等的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)保護(hù)劑的濃度為60% (V/V)時(shí)所有的保護(hù)劑基本上不會(huì)形成冰晶［18］。由此看來(lái)，此時(shí)進(jìn)行冷凍干燥，既沒(méi)有冰晶生成，也沒(méi)有出現(xiàn)玻璃化凍結(jié)，就相當(dāng)于在本研究的干燥過(guò)程中的風(fēng)干，這對(duì)凍干軟骨的生物力學(xué)性能可能破壞較大。

從圖7 可以看出，經(jīng)中低濃度DMSO 處理過(guò)的樣品，隨著預(yù)凍結(jié)速率的增大，楊氏模量減小。這可能的原因是在關(guān)節(jié)軟骨冷凍干燥期間，細(xì)胞內(nèi)外的水分凍結(jié)成冰，冰晶生長(zhǎng)產(chǎn)生了機(jī)械力量，會(huì)引起細(xì)胞損傷，這種損傷叫做“機(jī)械損傷”［19］。關(guān)節(jié)軟骨是種特殊的組織，是由少量的軟骨細(xì)胞和大量的細(xì)胞外基質(zhì)組成。細(xì)胞的主要作用是合成和分泌基質(zhì)蛋白，維持軟骨基質(zhì)的新陳代謝，而細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨的主要力學(xué)承載者。降溫速率越大，成核率也越大，形成數(shù)量很多的小冰晶。但是，冰晶生長(zhǎng)率相對(duì)較低，而降溫速率越小則相反，首先中低濃度DMSO，結(jié)合水太少。在快速預(yù)凍結(jié)過(guò)程中，軟骨細(xì)胞內(nèi)外冰晶體形成速度較快，細(xì)胞內(nèi)的水分尚未轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)結(jié)晶［20-21］。細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷體現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，影響的是軟骨細(xì)胞的分裂能力;而細(xì)胞外降溫時(shí)的成核率較低，冰晶生長(zhǎng)速度較快，形成的大量冰晶迅速引起宏觀體積的膨脹，破壞了膠原纖維的合理排列分布，使軟骨的支架結(jié)構(gòu)受到破壞，大大降低了軟骨的力學(xué)承載能力。從圖4 ～圖5 的掃描電鏡觀察結(jié)果可以看出，在快速預(yù)凍結(jié)的影響下，原本合理排布的膠原纖維聚集在一起，出現(xiàn)了明顯的纖維斷裂現(xiàn)象，而慢速預(yù)凍膠原出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象較為輕微。所以，在中低濃度范圍內(nèi)，預(yù)凍結(jié)速率越快，楊氏模量越小。

從圖8 可以看出，在中間濃度范圍內(nèi)，當(dāng)保護(hù)劑的濃度相同時(shí)，經(jīng)DMSO 處理的凍干樣品的楊氏模量最大，甘油的楊氏模量次之，丙二醇的楊氏模量最小。而在高濃度下3 種保護(hù)劑的保護(hù)效果差不多，這主要是由不同保護(hù)劑的官能團(tuán)決定的［22-23］。如圖9 所示，DMSO 的分子式中有2 個(gè)甲基，甘油有3 個(gè)羥基，丙二醇有2 個(gè)羥基和1 個(gè)甲基。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在相同濃度下，DMSO 的楊氏模量大于甘油的楊氏模量，大于丙二醇的楊氏模量。這種現(xiàn)象的原因:一方面，是因?yàn)镈MSO 結(jié)合水的能力最強(qiáng)，甘油結(jié)合水的能力次之，丙二醇結(jié)合水的能力最差;另一方面，也是因?yàn)镈MSO 滲入細(xì)胞的速率比甘油和丙二醇快，這無(wú)疑會(huì)使細(xì)胞受到更好的保護(hù)。Hey 等用DMSO 和丙三醇進(jìn)行了多組對(duì)照實(shí)驗(yàn)［24］，發(fā)現(xiàn)45% (V/V)DMSO 和50% (V/V)甘油在玻璃化轉(zhuǎn)變和反玻璃化趨勢(shì)方面有很多共性，這說(shuō)明在相同的濃度下，DMSO 的結(jié)合水能力可能比甘油的結(jié)合水能力要強(qiáng)。在給定的凍干保護(hù)劑中，除了含羥基化合物，還有含甲基化合物和既含羥基又含甲基的化合物。文獻(xiàn)［22 -23］的研究認(rèn)為，低溫保護(hù)效果甲基要好于羥基，因?yàn)榧谆c甲基之間沒(méi)有相互作用，只與水鍵合，而羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，從而會(huì)弱化對(duì)冰晶的抑制效果。DMSO 的分子式中有2 個(gè)甲基，甘油的分子式中有3個(gè)羥基。雖然甘油中羥基的數(shù)目為3 個(gè)，但是羥基自身也有鍵合作用，所以與水的結(jié)合能力比DMSO要小，導(dǎo)致了楊氏模量不如DMSO 的大。但是，丙二醇有2 個(gè)羥基和1 個(gè)甲基，甘油只有3 個(gè)羥基。所以籠統(tǒng)的通過(guò)比較羥基和甲基的數(shù)目是不行的［25］?？赡艿脑蚴歉视痛孀杂伤姆蓊~比丙二醇要高，所以，在相同濃度下，含有甘油的基質(zhì)內(nèi)的自由水比含有丙二醇的基質(zhì)內(nèi)的自由水少，導(dǎo)致甘油的楊氏模量大于丙二醇的楊氏模量。但是在低濃度和高濃度范圍內(nèi)楊氏模量的大小和凍干保護(hù)劑的種類之間沒(méi)有表現(xiàn)出這樣一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。產(chǎn)生這種情況的原因可能是:在濃度范圍內(nèi)凍干保護(hù)劑的作用效果不明顯，主要受預(yù)凍結(jié)速率的影響。在高濃度范圍內(nèi)，凍干保護(hù)劑水溶液的凍結(jié)溫度低于-60℃，加入凍干保護(hù)劑的樣品并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)完全凍結(jié)，導(dǎo)致冷凍干燥失敗，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正意義上的凍干，估計(jì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的膠原纖維的合理排列分布造成大的破壞，大大降低了軟骨的力學(xué)承載能力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了3 種凍干保護(hù)劑、7 種凍干保護(hù)劑濃度以及3 種預(yù)凍結(jié)速率對(duì)關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響，結(jié)果表明:

1)空白對(duì)照組的楊氏模量最大，添加凍干保護(hù)劑凍干樣本的楊氏模量次之，新鮮的未加保護(hù)劑凍干樣品的楊氏模量最小。

2)凍干保護(hù)劑在中低濃度范圍內(nèi)，楊氏模量隨著濃度的增大而增大;而在高濃度范圍內(nèi)，楊氏模量隨著濃度的增大而減小。

3)對(duì)于在中低濃度區(qū)間同一濃度的同一凍干保護(hù)劑，慢速預(yù)凍結(jié)更有利于保護(hù)其力學(xué)性能。

4)當(dāng)保護(hù)劑的濃度在中濃度區(qū)間時(shí)，相同濃度下DMSO 的楊氏模量最大，甘油的楊氏模量次之，丙二醇的楊氏模量最小。

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