自體表皮細胞-纖維蛋白膜創(chuàng)面移植治療大鼠燒傷

陳子英，王曉曄，崔華雷

實驗研究

自體表皮細胞-纖維蛋白膜創(chuàng)面移植治療大鼠燒傷

陳子英，王曉曄，崔華雷

目的：觀察自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植到大鼠燒傷創(chuàng)面治療皮膚缺損的效果。方法：健康Wistar大鼠20只，隨機分成燒傷皮膚缺損造模組和自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組，治療后計算表皮細胞在纖維蛋白膜上最佳接種密度，觀察移植后的各組創(chuàng)面愈合情況、創(chuàng)面?zhèn)诘氖湛s比例等。結(jié)果：在纖維蛋白膜上接種表皮細胞的最佳密度為5×104/cm2，燒傷皮膚缺損造模組創(chuàng)面完全愈合時間平均22.3 d，自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組為18.1 d，造模組創(chuàng)面收縮率為（70±5）%，移植組為（20±5）%（均P＜0.05）。結(jié)論：自體表皮細胞-纖維蛋白膜可用于覆蓋大面積燒傷造成的皮膚缺損，預(yù)防創(chuàng)面?zhèn)隈：刍男纬桑瑴p輕創(chuàng)面收縮率，加速皮膚缺損創(chuàng)面的愈合速度。

燒傷；大鼠；自體表皮細胞-纖維蛋白膜；移植

嚴重?zé)齻騽?chuàng)傷后大面積皮膚缺損，為覆蓋創(chuàng)面，表皮細胞懸液移植曾用來進行創(chuàng)面移植。因細胞懸液流動性大，細胞流失明顯，使表皮細胞發(fā)揮不了最大的作用，影響創(chuàng)面愈合的速度和質(zhì)量。2012年1月—2012年7月，我們進行了自體表皮細胞-纖維蛋白膜創(chuàng)面移植對大鼠燒傷的治療研究，評價自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療燒傷的效果。

1 材料與方法

1.1 表皮細胞的制備及鑒定 采用大鼠表皮胰蛋白酶消化法來完成表皮細胞的分離，應(yīng)用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，使用臺盼藍染色檢測表皮細胞活力。將表皮細胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時進行表皮細胞的免疫組織化學(xué)染色來鑒定表皮細胞。在光鏡下觀察原代培養(yǎng)表皮細胞的形態(tài)變化和生長情況。

1.2 纖維蛋白膜的制備 參照吳博等[1]的方法。取健康Wistar大鼠全血，置入預(yù)先裝有肝素抗凝劑的生化管中，在普通離心機中以3000 r/min，離心10 min。滴管吸取上層血漿，保存于4℃。凝血酶凍干粉劑予以無菌注射用水溶解稀釋。用0.22 μm無菌濾膜過濾法對血漿進行過濾除菌，將等體積血漿和已經(jīng)溶解稀釋的凝血酶各2 mL，分別均勻的鋪于無菌6孔板的孔中。底層先鋪1 mL凝血酶溶液，中間鋪2 mL大鼠血漿，上面再鋪凝血酶溶液1 mL。完成后靜置。30 min后吸出上清液，即制備得一個6孔板的纖維蛋白膜。將制作好盛有纖維蛋白膜的6孔板用無菌膠帶封口，保存于37℃。

用無菌注射水溶解稀釋凝血酶，使之溶液的濃度分別為1 mL：10 IU、1 mL：50 IU和1 mL：100 IU，按照上述方法分別制作不同凝血酶濃度的3種膜，每種膜制備一個6孔板，即6個膜。在靜置時，隨時觀察6孔板中凝固反應(yīng)的情況，并觀察纖維蛋白膜的一般性狀，測量其厚度，以及檢測纖維蛋白膜的抗張強度及伸長率，得出制備纖維蛋白膜所用血漿與凝血酶的最佳比例。

1.3 表皮細胞的接種密度及纖維蛋白膜為基質(zhì)培養(yǎng)表皮細胞的動態(tài)觀察 將原代培養(yǎng)的表皮細胞以將1×105/cm2，5×104/cm2，1×104/cm2的細胞密度接種到制備有纖維蛋白膜和空白的24孔板中。將預(yù)接種的表皮細胞分為A、B兩組。A組：纖維蛋白膜組，B組：空白對照組，分別將原代培養(yǎng)的表皮細胞以將1×105/cm2，5×104/cm2，1×104/cm2的細胞密度接種到24孔板中。即為：每組表皮細胞密度接種3個復(fù)孔，即為：

A1組：接種1×105/cm2密度的表皮細胞到有纖維蛋白膜的24板中，3個復(fù)孔。

A2組：接種5×104/cm2密度的表皮細胞到有纖維蛋白膜的24板中，3個復(fù)孔。

A3組：接種1×104/cm2密度的表皮細胞到有纖維蛋白膜的24板中，3個復(fù)孔。

B1組：接種1×105/cm2密度的表皮細胞到空白的24板中，3個復(fù)孔。

B2組：接種5×104/cm2密度的表皮細胞到空白的24板中，3個復(fù)孔。

B3組：接種1×104/cm2密度的表皮細胞到空白的24板中，3個復(fù)孔。

置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后計數(shù)上清液中的細胞數(shù)，根據(jù)以下公式：

計數(shù)表皮細胞的貼壁率。根據(jù)細胞貼壁率和預(yù)先接種的細胞數(shù)，可以計算不同接種密度下的貼壁細胞數(shù)，得出表皮細胞在纖維蛋白膜上的最佳接種密度，并觀察表皮細胞在以纖維蛋白膜基質(zhì)上的生長情況。

1.4 動物與分組 取健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±10）g，隨機分為2組。

燒傷皮膚缺損造模組，參照吳國群等[2]的方法進行制作。在大鼠背部制作出2 cm×2 cm的全層皮膚缺損，碘伏消毒，覆蓋凡士林油紗布，敷料包扎。

自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組：第一次在大鼠背部切取1 cm×1 cm大小的全層皮膚，分離培養(yǎng)大鼠的表皮細胞。用同種的大鼠血漿與由合適濃度凝血酶溶液相混合制備纖維蛋白膜。在纖維蛋白膜上以合適的細胞密度接種培養(yǎng)自體表皮細胞。

表皮細胞在纖維蛋白膜上培養(yǎng)24 h，在第一次取皮的皮膚缺損處擴大背部皮膚缺損達至2 cm× 2 cm，制作出大鼠背部皮膚缺損模型。將爬滿表皮細胞的纖維蛋白膜移植到皮膚缺損的創(chuàng)面，使爬有自體表皮細胞的一側(cè)對向創(chuàng)面。自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組每只大鼠的手術(shù)創(chuàng)面進行包扎，氨芐青霉素4萬IU肌注肌肉注射。

1.5 指標觀察 表皮細胞在纖維蛋白膜表面的生長狀況，移植后的創(chuàng)面是否發(fā)生感染，發(fā)生感染的例數(shù)，各組創(chuàng)面愈合情況、創(chuàng)面?zhèn)诘氖湛s比例等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，瘢痕愈合時間數(shù)據(jù)和創(chuàng)面收縮率數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表皮細胞制備及鑒定 通過表皮胰蛋白酶消化法可以得到數(shù)量足夠多且細胞活力良好的表皮細胞，經(jīng)細胞免疫組織化學(xué)鑒定，角蛋白抗體染色陽性（圖1），波形蛋白抗體染色陰性（圖2），可以確定分離出的細胞為表皮細胞。

2.2 纖維蛋白膜的制備 制作完成的纖維蛋白膜外觀呈半透明膠凍狀。3種不同凝血酶濃度的纖維蛋白膜的厚度均在100μm左右。將凝血酶用無菌注射水稀釋成1 mL∶10 IU后所制成的纖維蛋白膜塑型性差，成膜不均勻，易破裂，伸長率低。用稀釋比例1 mL∶50 IU和1 mL∶100 IU的凝血酶溶液所得到的纖維蛋白膜塑形性良好，不易破裂，有較好的伸長率。

2.3 表皮細胞的接種密度及纖維蛋白膜為基質(zhì)培養(yǎng)表皮細胞的動態(tài)觀察 表皮細胞在24孔板中培養(yǎng)24 h，吸出24孔板中各個培養(yǎng)孔的上清液，利用細胞計數(shù)的方法，分別計數(shù)上清液中的細胞數(shù)，最終得出的在24孔板中各組表皮細胞的貼壁率分別為，A1：（20±5）%，A2：（40±6）%，A3：（42±5）%；B1：（15±4）%，B2：（33±5）%，B3：（36±5）%。顯示在纖維蛋白膜上培養(yǎng)的表皮細胞的貼壁效果，明顯比直接在24孔板中的表皮細胞要好。當(dāng)接種的表皮細胞密度分別為1×105/cm2，5×104/cm2時，在24 h后均能鋪面纖維蛋白膜的表面和對照組24孔板的孔底，接種密度為1×104/cm2的表皮細胞在24 h僅僅能鋪滿培養(yǎng)孔板的65%，纖維蛋白膜上為75%?？梢?，當(dāng)接種的表皮細胞密度在5×104/cm2及以上時，24 h后的表皮細胞均能貼滿培養(yǎng)孔板的底部。1×1105/cm2的細胞接種密度浪費了很多的表皮細胞，當(dāng)接種密度為1×104/cm2時，接種的表皮細胞數(shù)量又不夠。在纖維蛋白膜上合適的表皮細胞接種密度為5×104/cm2。

圖1 表皮細胞角蛋白抗體染色陽性（100×）

圖2 表皮細胞波形蛋白抗體染色陰性（100×）

剛剛接種到24孔板的表皮細胞細胞呈圓形，單個或幾個細胞成團呈懸浮狀態(tài)，24 h后大部分的表皮細胞已經(jīng)貼附于纖維蛋白膜上，48 h后貼壁的表皮細胞變大，向四周鋪展。接種到纖維蛋白膜上的表皮細胞可以正常生長，纖維蛋白膜可以促進表皮細胞的貼壁率，兩者可以聯(lián)合得到表皮細胞-纖維蛋白膜。

2.4 術(shù)后感染情況 兩組共20只大鼠，無創(chuàng)面感染出現(xiàn)，無死亡。

2.5 創(chuàng)面愈合時間 自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組，移植后的第4 d，創(chuàng)面可見表皮細胞的皮島出現(xiàn)。術(shù)后第7 d，皮損的創(chuàng)面被覆新鮮細嫩的表皮組織，表面紅潤有光澤，表皮細胞增殖成復(fù)層。術(shù)后第10～14 d，移植治療后的創(chuàng)面表皮組織進一步成熟和分化，表皮層增厚，創(chuàng)面愈合良好，無結(jié)痂的出現(xiàn)。18 d，大鼠的皮膚缺損創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，傷口無瘢痕組織的形成（圖3～圖6）。燒傷造模組大鼠術(shù)后的第2 d，皮膚缺損創(chuàng)面就開始結(jié)痂，痂皮質(zhì)硬。術(shù)后第10 d，新生的肉芽組織和膠原替代了最初的結(jié)痂，同時創(chuàng)面四周的皮膚進一步收縮。術(shù)后14 d，創(chuàng)面基本愈合，但傷口收縮更為明顯。術(shù)后第22 d，皮膚缺損創(chuàng)面才完全愈合，瘢痕化的創(chuàng)面的呈現(xiàn)進一步的收縮態(tài)勢（圖7～圖10）。造模組創(chuàng)面完全愈合的時間平均為22.3 d，自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組為18.1 d（P＜0.05）。

圖3 自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植到大鼠皮損創(chuàng)面

圖4 自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組大鼠移植術(shù)后第4 d的創(chuàng)面情況

圖5 自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組大鼠移植術(shù)后第7 d的創(chuàng)面情況

圖6 自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組大鼠移植術(shù)后第14 d的創(chuàng)面情況

圖7 燒傷皮膚缺損造模組大鼠的皮膚缺損

圖8 燒傷皮膚缺損造模組大鼠術(shù)后2 d的創(chuàng)面情況

圖9 燒傷皮膚缺損造模組大鼠術(shù)后10 d的創(chuàng)面情況

圖10 燒傷皮膚缺損造模組大鼠術(shù)后14 d的創(chuàng)面情況

2.6 傷口愈合后收縮率比較 燒傷皮膚缺損造模組大鼠的創(chuàng)面收縮率為（70±5）%，自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組大鼠的創(chuàng)面收縮率為（20± 5）%（P＜0.05）。

3 討論

燒傷治療的首要問題是深度燒傷創(chuàng)面的存在，如何盡早、有效地封閉深度燒傷創(chuàng)面，是燒傷治療的根本任務(wù)。體表各部位創(chuàng)傷、燒傷愈合最后多以瘢痕形成而告終，瘢痕導(dǎo)致的機體形態(tài)改變與功能障礙，使患者生活不能自理，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。愈合時間超過3周的燒傷創(chuàng)面，形成增生性瘢痕的幾率很高。因為這種創(chuàng)面缺乏表皮，而表皮細胞可以控制成纖維細胞的分泌功能降低膠原的含量，且表皮細胞還可促進自身的分裂。在大面積燒傷皮膚創(chuàng)面缺損愈合的過程中，表皮細胞起著至關(guān)重要作用。

表皮細胞體外培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵，是表皮細胞分離過程。目前國內(nèi)外學(xué)者一般采用胰蛋白酶。一般而言，細胞分離時，胰蛋白酶的濃度越大、作用時間越長，對表皮細胞分離的能力就越大，但是超過一定的限度也會損傷細胞。其安全、有效的作用濃度為0.01%～0.5%，常用濃度為0.25%。在我們的實驗中，采用的是0.25%的胰蛋白酶在37℃時消化1～3 h。經(jīng)顯微鏡下細胞計數(shù)和進行細胞活力檢測，分離得到的表皮細胞數(shù)量和活力均達到了實驗要求。近些年來，還有很多學(xué)者使用分離酶[5]和熱溶素[6]進行分離表皮細胞。胰蛋白酶主要作用于基底層和基底上層的細胞，破壞基底上層橋粒結(jié)構(gòu)，常在真皮部分殘留大量的基底細胞，而使分離后的表皮細胞結(jié)構(gòu)欠完整。分離酶和熱溶素選擇性地消化真皮與表皮間的半橋粒結(jié)構(gòu)，因而可能獲得較多具有增殖能力的表皮細胞，減少人成纖維細胞的污染。雖然應(yīng)用分離酶Ⅱ或熱溶素和胰蛋白酶兩步消化法在分離表皮細胞的過程中，效果更好。我們在實驗中考慮到分離酶Ⅱ和熱溶素價格昂貴，不易獲得，在能夠滿足實驗要求的前提下，僅僅使用了胰蛋白酶一步消化法分離表皮細胞，分離得到的表皮細胞數(shù)量和活力能夠滿足實驗的要求。

原代、傳代培養(yǎng)或者處于亞融合、融合狀態(tài)的表皮細胞，皆可用于懸液移植以及時封閉皮膚缺損的創(chuàng)面，而且處于亞融合狀態(tài)的表皮細胞內(nèi)含有大量能形成細胞克隆的干細胞，具有較高的增殖活。在實際應(yīng)用的過程中我們發(fā)現(xiàn)，單純表皮細胞懸液移植也存在一些不足，移植后的表皮細胞懸液具有很大的流動性，細胞流失明顯，移植之后不一定能夠保證表皮細胞的在移植的創(chuàng)面良好地生長增殖，并且表皮細胞因創(chuàng)面覆蓋物的摩擦也會出現(xiàn)脫落等情況。這使得表皮細胞在燒傷皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)中的作用大大的打了折扣[7]，未能為臨床提供可行的辦法。針對這種情況，我們提出了應(yīng)用纖維蛋白膜作為培養(yǎng)表皮細胞的基質(zhì)，然后將自體表皮細胞接種到纖維蛋白膜上構(gòu)造出自體表皮細胞-纖維蛋白膜，最終移植到大面積燒傷皮膚缺損創(chuàng)面治療皮膚缺損的問題。

纖維蛋白膜是由凝血酶和血漿中的主要成分纖維蛋白原反應(yīng)形成，是一種可合成、可降解的、無毒的、具有良好生物相容性的生物材料膜[1]。凝血酶來源于人或動物血液中提取的凝血酶原,經(jīng)激活而獲得凝血酶的無菌凍干制劑，是一種止血藥，有促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的作用，適用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細血管以及實質(zhì)性臟器出血的止血[8-9]，用于外傷、手術(shù)、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、燒傷、骨科、神經(jīng)外科、眼科、婦產(chǎn)科以及消化道等部位出血的止血。纖維蛋白原是血漿中含量最高的一種凝血蛋白，為凝血因子I。在纖維蛋白膜的制備過程中，當(dāng)纖維蛋白原與凝血酶混合后（有溶解稀釋液的情況下），纖維蛋白原在凝血酶的作用下裂解，凝血酶斷裂纖維蛋白原的鏈而釋放出酸性多肽A、B，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，隨之聚合成纖維蛋白多聚體，通過兩者之間的反應(yīng)形成了纖維蛋白膜。

我們應(yīng)用自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療大鼠大面積皮膚缺損的創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)移植到創(chuàng)面后的表皮細胞能夠很好地生長增殖。在移植后的第4 d，創(chuàng)面可見表皮細胞的皮島出現(xiàn)。到了術(shù)后第7 d，皮損的創(chuàng)面被覆新鮮細嫩的表皮組織，表面紅潤有光澤，表皮細胞增殖成復(fù)層。在術(shù)后的第10 d到第14 d時，移植治療后的創(chuàng)面表皮組織進一步成熟和分化，表皮層增厚，創(chuàng)面愈合良好，無結(jié)痂的出現(xiàn)。到了18 d時，大鼠的皮膚缺損創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，傷口無瘢痕組織的形成。而模型組大鼠的創(chuàng)面愈合過程是，術(shù)后第2 d，大鼠的皮膚缺損創(chuàng)面就開始結(jié)痂，痂皮質(zhì)硬。到術(shù)后第10 d，新生的肉芽組織和膠原替代了最初的結(jié)痂，同時創(chuàng)面四周的皮膚進一步收縮。術(shù)后14 d，大鼠的創(chuàng)面基本愈合，但傷口收縮更為明顯。直到術(shù)后的第22 d，大鼠的皮膚缺損創(chuàng)面才完全愈合，瘢痕化的創(chuàng)面的呈現(xiàn)進一步的收縮態(tài)勢。同時通過兩組大鼠創(chuàng)面愈合后的傷口收縮率的比較，自體表皮細胞-纖維蛋白膜移植治療組的皮膚缺損創(chuàng)面的收縮程度明顯的比模型組的要輕。

自體表皮細胞和纖維蛋白膜兩者結(jié)合構(gòu)成的自體表皮細胞-纖維蛋白膜，其中表皮細胞可以依托纖維蛋白膜更好地局限于燒傷皮膚缺損創(chuàng)面表面生長增殖，使其能更有效的在燒傷后的創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮重大作用。同時，在當(dāng)自體表皮細胞移植到皮膚缺損的創(chuàng)面之后，創(chuàng)面充當(dāng)了“體內(nèi)表皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”的角色。我們移植到創(chuàng)面的表皮細胞均來自大鼠自己本身，沒有組織排異反應(yīng)的發(fā)生，隨著移植到皮膚缺損創(chuàng)面上的表皮細胞進一步地生長增殖與分化，最終形成新的上皮，使得創(chuàng)面皮膚完美地愈合。

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（收稿：2013-06-26 修回：2013-09-22）

（責(zé)任編輯 李蘭青 屈振亮）

Treatment of Burn by Transplanting Fibrinous Membrane with Autologous Epidermal Cells on Raw Surface

CHEN Zi-ying,WANG Xiao-ye,CUI Hua-lei Department of Pedatric Surgery,Tianjin Children’s Hos?pital,Tianjin(300074),China

Objective To observe the treatment effect of skin defect by transplanting fibrinous membrane with autologous epidermal cells to burn wounds in rats,and to look for new ways to treat the burn caused by large area skin defect.MethodsTwenty healthy Wistar rats were randomly divided into burn skin defect mod?ule group and fibrinous membrane with autologous epidermal cells transplanting group.The optimum epidermal cells inoculation density on fibrinous membrane was calculated.The wound healing and the wound contraction ratio after fibrinous membrane with autologous epidermal cells transplantation were observed.ResultsThe best density on fibrinous membranes with epidermal cells was 2.5x104/cm2,burn skin defect module group rats wound healed completely spening an average of about 22.3 days,and the fibrinous membrane with autologous epidermal cells transplantation treatment group rats wound healed completely time was about 18.1 days on aver?age;the wound shrinkage rate of burn skin defect module group rats was（70±5）%,and transplantation group rats was（20±5）%.ConclusionThe fibrinous membrane with autologous epidermal cells can be used to cover large area skin defect caused by burn,and can prevent scar formation,reduce wound shrinkage rate,to acceler?ate wound healing,thus playing an important role in curing large burn skin defect.

Wistar rats；burn；fibrinous membrane with autologous epidermal cells；transplant

Q95-33;R644

A

1007-6948(2013)06-0660-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.016

天津市兒童醫(yī)院外科（天津 300074）

崔華雷，E-mail：chzy001@126.com