組織芯片檢測Claudin-3在前列腺癌中的表達

朱永鋒，張春霆，張洪團，張昌文，徐 勇

組織芯片檢測Claudin-3在前列腺癌中的表達

朱永鋒1，張春霆2，張洪團3，張昌文3，徐 勇3

目的：檢測Claudin-3在前列腺癌中的表達情況，探討其與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。方法：采用組織芯片技術構建包含64例前列腺癌和39例前列腺增生組織的64點陣石蠟組織芯片，用免疫組化SP法檢測該芯片中Claudin-3的表達，分析其與前列腺癌Gleason評分和臨床分期的關系。結果：前列腺癌Claudin-3陽性表達率為60.94%（39/64），前列腺增生表達率17.95%（7/39）（P＜0.05）；Claudin-3與前列腺癌Gleason評分和臨床分期明顯相關。結論：Claudin-3異常表達與前列腺癌發(fā)生發(fā)展有密切關系。

前列腺癌；Claudin-3；組織芯片；免疫組織化學

前列腺癌的發(fā)生進展是一個多因素多階段的過程，涉及多個基因突變及表達異常。Claudins是緊密連接結構中的重要組成部分，其結構和功能的改變是許多疾病的基礎[1]，其家族成員Claudin-3與前列腺癌的關系未見報道。我們利用組織芯片技術和免疫組織化學染色鏈霉菌抗生物素蛋-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法，對Claudin-3在前列腺癌中的表達情況進行了檢測，探討其與前列腺癌的臨床病理聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 64例前列腺癌組織標本來自浙江大學金華醫(yī)院和天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院2007年1月—2010年1月病理組織庫標本，患者年齡57～69歲，平均（54.5±8.5）歲。前列腺增生組織取自同期非腫瘤患者，39例患者年齡52～71歲，平均（56.5±6.5）歲。兩組年齡相比無顯著性差異。前列腺癌根據(jù)2002年TNM分期標準，I～II期41例，III～IV期23例。Gleason評分＜7分的36例，Gleason評分≥7分的28例。前列腺癌術前均未接受放療、化療和內分泌治療，標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μ m厚連續(xù)切片。

1.2 方法 SP試劑盒和DAB顯色劑均為北京中杉生物技術公司產品。構建2個8×8點陣的組織芯片，一個用于免疫組化染色，一個用于陰性對照。對所制成芯片的所有組織（須有與其匹配的標記完成的HE片）進行點陣。根據(jù)標記，利用點陣儀對標記完成的組織進行打點取樣，黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。每例前列腺癌標本和前列腺增生組織標本均取1個點?？酒? h，芯片制作完成。應用SP法進行兔抗人Claudin-3蛋白單克隆抗體免疫組化染色。組織切片60℃烤片，常規(guī)脫蠟、抗原修復，0.3%H2O2-甲醇封閉內源性過氧化物10 min，滴加一抗（1∶100），4℃冰箱過夜。以PBS代替一抗作陰性對照。次日滴加生物素標記的二抗（兔）及鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，均室溫孵育12 min。各步驟間均以0.1%Tween-PBS洗5 min×3次。最后DAB顯色，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3 結果判定 Claudin-3染色主要是細胞膜出現(xiàn)棕紅色顆粒為陽性染色，細胞漿及細胞核表達很少，根據(jù)陽性表達細胞數(shù)區(qū)分表達等級。（-）為陽性表達細胞數(shù)＜10%，（+）為陽性表達細胞數(shù)10%～25%，（++）為陽性表達細胞數(shù)＞50%，（+++）為陽性表達細胞數(shù)＞75%。陽性表達細胞數(shù)＞10%陽性表達，陽性表達細胞數(shù)≤10%為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對染色結果用成組設計兩樣本陽性率比較進行χ2檢驗（或者Fisher概率法），P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Claudin-3在前列腺癌中的表達 免疫組化染色結果發(fā)現(xiàn)，Claudin-3主要表達在細胞膜上，而在胞質及胞核中表達不明顯（見圖1、圖2）。

圖1 Claudin-3在前列腺增生組織中的表達（×100）

2.2 Claudin-3在前列腺癌和增生組織中的表達Claudin-3在前列腺癌中呈高表達，染色強度及陽性細胞數(shù)明顯高于前列腺增生組織。在前列腺癌組織中表達的陽性率為60.94%（39/64），在前列腺增生組織中陽性表達率為17.95%（7/39）。見表1。

2.3 Claudin-3表達與前列腺癌Gleason評分和臨床分期之間的關系 Claudin-3在36例前列腺癌＜7分的陽性表達率為41.67%（15/36），Claudin-3在28例前列腺癌≥7分的表達率為85.71%（24/28），兩者之間比較有差異。在前列腺癌臨床分期中，I～II期表達率53.66%（22/41）和III～IV期陽性表達率為82.61%（19/23），兩者相比有明顯差異。見表1。

表1 Claudin-3在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達

3 討論

前列腺癌是歐美國家常見的腫瘤[2]，其疾病特異性死亡率有上升趨勢[3]。近年來，前列腺癌在我國呈逐漸增加趨勢[4]。由于我國目前大多不能早期發(fā)現(xiàn)，同時很大一部分患者由于發(fā)現(xiàn)較晚，亦錯失手術時機。隨著分子生物學的發(fā)展，人們對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制的認識有了長足的進步。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌與多種基因有關。Claudin-3基因參與了多種腫瘤的發(fā)生進展，其翻譯的蛋白屬于一類跨膜緊密連接蛋白，主要作用是維持細胞的極性和細胞間屏障功能[5-6]，在跨膜蛋白在細胞間的傳輸轉運中起著重要作用，也是細胞黏附功能的基礎。其異常表達使上皮滲透屏障破壞,細胞極性喪失,細胞間黏附力下降,導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

Claudin-3蛋白及其他緊密連接蛋白的表達異常，目前被認為是細胞間黏附性丟失的機制和腫瘤細胞發(fā)生及轉移的重要步驟。然而在多數(shù)腫瘤組織中，Claudin-3表達水平明顯較正常組織中高，這意味著Claudin-3表達的上調在腫瘤的發(fā)生中也起促進作用。本研究采用組織芯片技術，對前列腺癌組織和前列腺增生組織進行了研究，檢測結果發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和良性前列腺增生組織中表達水平有顯著的差異，在前列腺癌組織中Claudin-3表達的陽性率為60.94%（39/64），在前列腺增生組織中陽性表達率為17.95%（7/39）。結果表明，Claudin-3在前列腺癌和良性前列腺增生組織表達變化與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展可能有密切關系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中36例Gleason評分＜7分的陽性表達率為41.67%（15/36），在28例前列腺癌Gleason評分≥7分的表達率為85.71%（24/28），兩者之間比較有差異。在對前列腺癌臨床分期中，I～II期表達率53.66%（22/41），III～IV期陽性表達率為82.61%（19/23），兩者相比有明顯差異。說明其表達與前列腺癌的臨床分期和Gleason評分有關，Claudin-3的異常表達參與了前列腺癌的發(fā)生和進展。本研究利用Claudin-3與產氣莢膜梭菌腸毒素 (clostridium perfringens enterotoxin，CPE)的受體結合，靶向干擾Claudin-3，前列腺癌細胞系PC3/DU145細胞增殖能力下降，細胞遷移能力降低。據(jù)此可以通過CPE作為載體，為靶向干擾Claudin-3對前列腺癌細胞產生特異性的細胞溶解作用[9]。靶向干擾Claudin-3表達上調的腫瘤治療新方法提供理論和實驗依據(jù)，為前列腺癌的治療提供了新的思路。

本實驗應用免疫組化SP技術對組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)Claudin-3在前列腺癌中高度表達，其表達主要在細膜上，而在胞質及胞核中表達不明顯。Claudin-3在前列腺癌的細胞膜中表達增強，這可能與它參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展細胞信號傳導有關。實驗中，在前列腺增生組織Claudin-3亦呈低表達或無表達，這說明雖然Claudin-3在前列腺癌中的表達不具有特異性，但前列腺癌早期即發(fā)現(xiàn)有Claudin-3異常表達，也使Claudin-3在前列腺癌的早期診斷中可能具有重要價值。同時，前列腺增生時的低表達說明Claudin-3在前列腺癌的發(fā)生中可能具有非常重要的作用，其在腫瘤轉移和增殖中可能發(fā)揮非常重要的作用。國內畢罡等[10]采用免疫組化法半定量測定前列腺癌80例、前列腺增生組織20例中Claudin-3的表達，并用蛋白印跡結合圖像分析法定量測定前列腺癌和前列腺增生組織的Claudin-3的表達，結果也顯示，前列腺癌組織中Claudin-3的表達顯著高于良性前列腺增生組。據(jù)此推測，Claudin-3可能對診斷前列腺癌有輔助診斷作用，Claudin-3可能是前列腺癌發(fā)生和演進中的早期事件之一。研究顯示，Claudin-3表達上調促進腫瘤生長機制可能是：Claudin-3表達的上調是促進癌細胞的侵襲力和生存力,而這種效應可能與增強了基質金屬蛋白酶-2的活性有關[11]。Claudin-3可被WNK4激酶催化磷酸化，推測Claudin-3可能有磷酸化后破壞細胞間緊密連接的正常功能。最近對Claudin-1研究結果顯示，Claudin-1過表達還可以抑制E-cadherin表達，失去E-cadherin表達使E-cadherin/Tcf信號通路上調[12]。但是Claudin-3在前列腺癌中表達上調是否有相同的機制起作用，還需要進一步研究。

本研究將組織芯片技術和免疫組化技術相結合，同時對多個前列腺癌和前列腺增生組織進行了Claudin-3蛋白的檢測，相對于普通切片，具有以下優(yōu)點：⑴體積小，信息含量高；⑵最大限度地利用有限的標本資源；⑶適用于形態(tài)學觀察，并可進行免疫組織化學染色的觀察和研究；⑷高效、快速、低消耗、自身內對照，可比性強。我們的研究結果顯示Claudin-3表達的上調與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關,在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。但Claudin-3功能復雜多樣，其在前列腺癌發(fā)生進展中的作用遠未闡明，尚需更進一步研究。

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（收稿：2012-12-09 修回：2013-09-12）

（責任編輯 張亞強）

Expression and Significance of Claudin-3 in Prostate Cancer with Tissue Microarray

ZHU Yong-feng,ZHANG Chun-ting,ZHANG Hong-tuan，et al Department of Urology,Jinhua People’s Hospital of Zhejiang Province,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate relationship of the generation and development of prostate cancer through detecting Claudin-3 expression of prostate cancer.MethodsTissue microarray technology were used to be built the lattice containing 64 patients with prostate cancer tissue and 39 patients with benign prostatic hy?perplasia tissue were arranaged for paraffin microarray and immunohistochemical SP method was used to detect Claudin-3 expression in the chip,the relationship between prostate cancer with Gleason score and the clinical stage was analyzed.ResultsIn 64 patients with prostate cancer,Claudin-3 positive expression rate was 60.94%(39/64),compared with in those with benign prostatic hyperplasia 17.95%（7/39）,there was significant difference,Claudin-3 expression in prostate cancer was significantly related to Gleason score and clinical stage（P＜0.05）.ConclusionAbnormal expression of Claudin-3 is closely related to generation and development of prostate cancer.

Prostate cancer Claudin-3;tissue microarray;immunohistochemistry

R737.25

A

1007-6948(2013)06-0636-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.008

1.浙江省金華市人民醫(yī)院泌尿外科（金華 321000）

2.浙江大學金華醫(yī)院泌尿外科（金華 321000）

3.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科（天津 300211）

徐 勇，E-mail:xuyong1955@sina.com