莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠血小板聚集的影響①

程華，孫芳玲，王曉鋒,，艾厚喜，張麗，陳乃宏，王文

·專題·

莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠血小板聚集的影響①

程華1，孫芳玲1，王曉鋒1,2，艾厚喜1，張麗1，陳乃宏2，王文1

目的 觀察莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的局灶性腦缺血再灌注大鼠血小板聚集指數(shù)的影響。方法用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。將48只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷低、中、高劑量組(30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg)和阿司匹林組(10 mg/kg)。利用透光比濁法檢測(cè)大鼠血小板聚集率。結(jié)果與模型組相比，高劑量莫諾苷組血小板最大聚集率顯著降低(P＜0.001)。結(jié)論莫諾苷具有抑制血小板聚集的作用。

莫諾苷；二磷酸腺苷；血小板聚集；缺血/再灌注；大鼠

[本文著錄格式]程華，孫芳玲，王曉鋒，等.莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠血小板聚集的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(2):101-103.

我國(guó)腦卒中發(fā)病率居世界第一，在我國(guó)居民死亡原因中位居首位，為家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。缺血性腦損傷是腦卒中最常見(jiàn)的類型，其病理機(jī)理復(fù)雜，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。缺血性腦損傷會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而增加血小板相應(yīng)受體的表達(dá)，使血小板功能亢進(jìn)，形成血栓。因此，抗血小板聚集、抗血栓治療在預(yù)防缺血性腦損傷和急性心肌梗死等方面占據(jù)著不容忽視的地位。

中藥山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus offcinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)肝益腎、澀精固脫的作用。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到單體化合物莫諾苷(morroniside)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[1-5]，能減小腦梗死體積[2]，增強(qiáng)皮層抗氧化[3]、抗炎[4]和抗凋亡能力[5]；并在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有一定作用[6]。本文旨在探討莫諾苷在體抗局灶性腦缺血大鼠血小板聚集的作用，以便全面了解莫諾苷的藥理作用，深入探討其治療局灶性腦缺血的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重260～280 g，平均(260±20)g，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(軍)2007-004。

1.2 藥物

莫諾苷：由本室從山茱萸中提取制備，采用高效液相分析，純度約98.5%，蒸餾水溶解配制新鮮溶液；阿司匹林(acetyl salicilic acid,ASA)：SIGMA公司，蒸餾水溶解，0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0。

1.3 試劑和儀器

二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)：SIGMA公司，配制成7.5 mg/ml儲(chǔ)存液，-20℃密封凍存，使用終濃度為10μmol/L。SC-2000高性能四通道血小板聚集儀：北京賽科希德公司；Microfuge低溫離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 采用Longa等[7]所介紹的大腦中動(dòng)脈線栓模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)并稍加改進(jìn)。大鼠術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛(400 mg/ kg)腹腔注射麻醉后，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌分離肌肉和筋膜，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。分離右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。于近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，且在頸總動(dòng)脈分岔處結(jié)扎頸外動(dòng)脈。動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在近心端距頸總動(dòng)脈分岔約4 mm處用眼科剪剪一斜行細(xì)小動(dòng)脈切口，將直徑0.28 mm的栓線從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，此時(shí)栓線已進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈起始部，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供，造成大腦中動(dòng)脈供血相關(guān)區(qū)的梗死灶。栓塞30 min后緩慢拔出栓線，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組8只大鼠除插入栓線深度為10 mm外，其余操作與造模大鼠相同。

1.4.2 分組及給藥 大鼠蘇醒后提尾時(shí)出現(xiàn)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收屈曲，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，站立時(shí)向?qū)?cè)傾倒等癥狀即為MCAO模型成功。隨機(jī)將MCAO成模大鼠分為：模型組，莫諾苷低、中、高劑量組(30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg)和ASA組(10 mg/kg)，每組8只。采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃。

1.4.3 最大聚集率的測(cè)定 取末次給藥后完成神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的大鼠，用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，與3.8%枸櫞酸鈉按9∶1(V/V)混勻，230 g離心10 min后取上清液即得富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)，將剩余血液以800 g離心10 min后去上清液即得去血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)，用PPP將PRP調(diào)為(400～500)× 109/L[8]。各組PRP 37℃恒溫孵育5 min，測(cè)定時(shí)分別加入誘導(dǎo)劑ADP(終濃度10μmol/L)，以SC-2000血小板聚集儀，按透光比濁法[9]測(cè)定3 min內(nèi)血小板最大聚集率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組血小板聚集率顯著升高(P＜0.001)。莫諾苷灌胃用藥7 d，中劑量組有抑制血小板聚集的趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；而莫諾苷高劑量組血小板聚集率與模型組比較顯著降低(P＜0.001)。與模型組相比，ASA組血小板聚集率顯著降低(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

表1 莫諾苷對(duì)MCAO模型大鼠ADP誘導(dǎo)血小板聚集的影響

3 討論

腦卒中是繼心臟病和癌癥之后的全球第三大疾病，其中缺血性腦血管病患者在腦卒中患者中占極大比例，有著高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭造成巨大負(fù)擔(dān)。缺血性腦血管病主要是由于一條或多條腦內(nèi)動(dòng)脈被血栓阻塞，最終導(dǎo)致局部或者全腦供血不足甚至完全中斷，進(jìn)而引起腦組織缺血、缺氧，甚至發(fā)生梗死等一系列異常的病理和生化變化。目前確切有效的治療缺血性腦血管病的方法就是盡早溶栓[10]。

血小板聚集功能在病理性血栓形成過(guò)程中起著重要的作用，而ADP受體拮抗劑(氯吡格雷)、血栓素A2抑制劑(阿司匹林)、磷酸二酯酶抑制劑(雙嘧達(dá)莫)、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體抑制劑(替羅非班)等抗血小板聚集藥物預(yù)防和治療缺血性腦血管病的療效已經(jīng)得到臨床證實(shí)。但此類藥物選擇性較差，容易產(chǎn)生消化性潰瘍、腹瀉、頭暈、皮疹等不同程度的不良反應(yīng)。因此，研制選擇性高、不良反應(yīng)少、作用強(qiáng)的新型抗血小板聚集藥物成為了近年來(lái)藥物研究的熱點(diǎn)。

利用中醫(yī)活血化瘀方劑來(lái)治療腦血管病歷史悠久，其中一些中藥有效成分及單體化合物如阿魏酸乙酯、莪術(shù)二酮、銀杏內(nèi)酯等已經(jīng)被證實(shí)能夠通過(guò)抑制血小板聚集達(dá)到活血化瘀的療效。

各種不同的內(nèi)源性誘導(dǎo)劑如ADP、血小板活化因子、花生四烯酸等均可誘導(dǎo)體內(nèi)血小板聚集反應(yīng)。前期實(shí)驗(yàn)表明，莫諾苷對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用選擇性最強(qiáng)[6]。血小板膜上有著豐富的表面ATP酶，是防止血小板凝聚所必須的。ADP通過(guò)抑制表面ATP酶活性來(lái)使血小板發(fā)生聚集。另外ADP還可以使血小板暴露出磷脂表面，通過(guò)Ca2+搭橋使血小板相互凝聚。本文采用ADP作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MCAO模型大鼠的血小板聚集，莫諾苷高劑量組(270 mg/kg)給藥7 d可以顯著降低MCAO模型大鼠的血小板聚集率，表明莫諾苷可能通過(guò)抑制血小板聚集發(fā)揮抗血栓作用。

由于體內(nèi)血小板聚集進(jìn)一步形成血栓的機(jī)制很復(fù)雜，莫諾苷抗血小板聚集治療缺血性腦血管病的作用仍需進(jìn)一步研究。

[1]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull, 2010,83(5):196-201.

[2]劉秀平,許棟明,王文,等.莫諾苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型腦梗死體積的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(10): 913-915.

[3]艾厚喜,李蕾,許棟明,等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15 (9):833-834.

[4]艾厚喜,汪瑩,許棟明,等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層IL-1β的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2010,16(10): 928-930.

[5]汪瑩,高東明,許棟明,等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Caspase-3活化程度的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2010, 16(9):801-802.

[6]王曉峰,陳乃宏,王文.莫諾苷對(duì)家兔血小板聚集的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2010,16(11):1029-1030.

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Effect of Morroniside on Platelet Aggregation in Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

CHENG Hua,SUN Fang-ling,WANG Xiao-feng,et al.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo explore the effects of morroniside on platelet aggregation induced by adenosine diphosphate(ADP)in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.Methods48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group,morroniside dose groups(30 mg/kg,90 mg/kg,270 mg/kg)and acetyl salicilic acid(ASA)group(10 mg/kg).The model of middle cerebral artery occlusion(MCAO)was established in all rats except the sham group.Born's turbidimetry was used to measure platelet aggregation rate in rats of MCAO model(in vivo).ResultsCompared with the model group,the platelet aggregation decreased significantly in the morroniside high dose group(P＜0.001).ConclusionMorroniside has the effect of anti-platelet aggregation in focal cerebral ischemia/reperfusion in rats.

morroniside;adenosine diphosphate;platelet aggregation;ischemia/reperfusion;rats

R743

A

1006-9771(2013)02-0101-03

2012-09-05)

1.科技部“十二五”重大創(chuàng)新藥專項(xiàng)(No.2012ZX09102-201-016)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81173575)；3.國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30740053)；4.北京市自然科學(xué)基金(No.7062031)；5.北京市教委科研基地-科技創(chuàng)新平臺(tái)(No.111219)；6.北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(No. 2011-3-097)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市100053；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京市100050。作者簡(jiǎn)介：程華(1988-)，女，苗族，貴州思南縣人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理與中藥藥理。通訊作者：王文。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.001