大麻莖腐病菌的分離及其對土壤環(huán)境影響的研究

鄭 楠，宋憲友，張利國，房郁妍，殷 博

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江省微生物研究所，黑龍江哈爾濱150086）

大麻是一種生命力很強(qiáng)的一年生高大草本作物，具有耐寒、抗旱等多種優(yōu)點(diǎn)。大麻植株自身可抵御各種病蟲害，不需施加肥料、殺蟲劑，且能夠有效地改良土壤的鹽堿化。大麻與大豆、玉米等糧食作物輪作，既可以保持土壤的肥力，也可以修復(fù)長期施肥造成的土壤污染。同時(shí)，大麻纖維長而堅(jiān)韌，耐腐蝕性強(qiáng)，用大麻纖維織成的布料具有透氣性好、吸水性強(qiáng)、耐磨、抗菌除臭等多種優(yōu)點(diǎn)[1，2]，在改良土壤的同時(shí)也能帶來極大的經(jīng)濟(jì)收入。大麻莖部病害的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致韌皮纖維腫大、腐爛，嚴(yán)重影響大麻纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量，病害高發(fā)時(shí)，給農(nóng)民的收入帶來極大的損失。因此，對大麻莖部病害的發(fā)生、防治需要引起足夠的重視。本研究從發(fā)病的大麻莖稈中分離病原菌，對病原菌的形態(tài)、生長條件進(jìn)行測定，并對大麻對土壤pH值的影響進(jìn)行初步的探索，以期為今后大麻對土壤環(huán)境影響的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的大麻病變組織。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌的分離及純化

采集新鮮的大麻病變莖稈，反復(fù)沖洗。對病變組織進(jìn)行表面消毒，分別用75%的酒精和無菌水浸泡3min，重復(fù)3次。將經(jīng)過表面消毒的組織置于已配好的PDA培養(yǎng)基平板中，培養(yǎng)3～7 d。在長出的菌落中挑取單菌落進(jìn)行純化[3]。

1.2.2 病菌形態(tài)觀察

刮取菌絲體壓片，顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。用無菌水沖洗菌落，制成孢子懸浮液，在載玻片中央滴一滴孢子懸浮液，用顯微鏡觀察孢子形態(tài)[3，4]。

1.2.3 不同pH值對病菌生長的影響

將培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基中的病原菌打成直徑為5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接到pH值分別為2，4，6，8，10，12的PDA平板上，在28℃條件下培養(yǎng)相同時(shí)間，測量菌落生長直徑，確定病菌的生長量[5]。

1.2.4 土壤pH對比試驗(yàn)

采用盆栽試驗(yàn)，初步探索種植大麻前后對土壤pH值的影響，在輕度鹽堿地塊取土，土壤pH為10.4，10次重復(fù)，每盆種植3株大麻，1個(gè)空盆不種大麻作為對照。大麻收獲后，測量土壤pH的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌的分離及純化

從大麻產(chǎn)生病變的莖稈中分離得到3株真菌，經(jīng)多代純化后，回接至大麻植株，其中2株病菌對大麻植株具有較強(qiáng)的致病力，分別命名為DN1、DN2。將兩株病菌分別利用針刺法回接到大麻植株上，植株5～7 d后出現(xiàn)感病癥狀。收集病變部位再次進(jìn)行病原菌的分離，其病原菌在顯微鏡下與DN1、DN2一致。病菌在潮濕、高溫的條件下容易導(dǎo)致植株發(fā)病，侵染莖稈初期，大麻莖稈出現(xiàn)不規(guī)則黃褐色斑塊，且輪廓不明顯，中心有黑色霉層，后期可導(dǎo)致莖稈彎曲、干枯，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)導(dǎo)致莖稈折斷。

圖1 大麻莖腐病局部接種癥狀

2.2 病菌的形態(tài)觀察

2.2.1 病菌菌落形態(tài)

分離得到的兩株病原真菌菌落見圖2。病原真菌DN1在PDA培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)72 h，菌絲生長旺盛，放射狀生長并形成規(guī)則的圓形菌落。另一株真菌命名為DN2，該真菌在PDA培養(yǎng)基中生長較為緩慢，需培養(yǎng)144 h，菌落開始為白色，培養(yǎng)一段時(shí)間后呈黃色，多為氣生菌絲，菌落呈絨毛狀突起。

圖2 DN 1（a）和DN 2（b）的菌落形態(tài)

2.2.2 病菌菌絲及孢子形態(tài)觀察

DN1菌絲及孢子形態(tài)見圖3，其菌絲體長，生長旺盛，具有分節(jié)結(jié)構(gòu)，分支較少。DN1具有非常強(qiáng)的產(chǎn)孢能力，在視野中能見到大量的淡褐色至深褐色、磚隔狀的分生孢子，形狀成卵圓形，頂端有喙?fàn)罴?xì)胞。根據(jù)菌絲和孢子的形態(tài)特征可初步確定其為半知菌亞門真菌，鏈格孢屬（Alternaria alternata）。[6]

圖3 DN 1菌絲（a）及孢子（b）形態(tài)

DN2菌絲及孢子形態(tài)見圖4，其菌絲體生長非常旺盛，不分節(jié)，分生孢子梗很短，在菌絲上成輪狀分布。分生孢子小、單生、圓形且數(shù)量很大。由于其形態(tài)特征不是十分明顯，初步推測其可能為半知菌亞門，輪枝孢屬（M.Verticillium）[6]，應(yīng)通過分子鑒定明確其所屬門類。

圖4 DN 2菌絲（a）及孢子（b）形態(tài)

2.3 不同pH值對病菌生長的影響

在PDA培養(yǎng)基上，對兩種病原真菌在pH值為4，6，8，10，12，14條件下的生長情況進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7、圖8。從結(jié)果可以看出，菌株DN1具有更強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力，能夠在更寬的pH范圍內(nèi)正常生長。兩株菌在pH值低于4的條件下都不能生長，在pH值6～12的范圍都生長良好。DN1的耐堿性明顯強(qiáng)于DN2，pH值大于12以后，DN2的生長明顯受到了抑制，而DN1仍表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生長現(xiàn)象。

從兩株病原真菌對pH值的適應(yīng)性來看，病害的發(fā)生有著較寬的pH范圍，對環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)。

表1 不同pH值菌株DN 1、DN 2的菌落生長直徑

2.4 土壤pH對比試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，大麻收獲后，土壤的pH值有顯著的變化，pH值降低的趨勢較為明顯。說明大面積種植大麻具有改良土壤堿性的潛力，其具體機(jī)制可對其根系微生物進(jìn)行深入的研究，以便進(jìn)一步開發(fā)大麻改善耕作土壤的能力。

表2 種植大麻后土壤pH值變化

3 結(jié)論與討論

通過對病變組織的培養(yǎng)，分離并純化得到兩株病原真菌DN1和DN2，回接試驗(yàn)表明其對大麻有致病力。對兩株病原真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，通過菌落、菌絲及孢子的形態(tài)，初步確定DN1為半知菌亞門真菌，鏈格孢屬（Alternaria alternata），DN2為半知菌亞門，輪枝孢屬（M.Verticillium）。

兩株病原真菌對pH值的適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果表明，兩株病原真菌對pH值均有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在pH值為4～12的環(huán)境下生長情況良好。其中，DN1對pH有更寬的適應(yīng)能力，在pH值達(dá)到14時(shí)，仍具有一定的生長能力，說明病害的發(fā)生對環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。

種植大麻后的土壤pH值發(fā)生了較為顯著的變化，說明大麻具有改善堿性土壤的潛力，其纖維又具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此大麻與糧食作物輪作，既可以改良土壤品質(zhì)，又能夠使農(nóng)民增收，應(yīng)對其改良土壤的機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

[1]宋憲友，張利國，房郁妍，等.黑龍江省發(fā)展大麻的優(yōu)勢與主要栽培技術(shù)[J].中國麻業(yè)科學(xué)，2011，33（1）：27-30.

[2]關(guān)鳳芝.大麻遺傳育種與栽培技術(shù)[M].哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[3]沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[4]莊新霞，江英，葉青任，等.小白杏軟腐病病原菌的分離鑒定[J].食品工業(yè)，2011（6）：92-93.

[5]楊懷光，孟慶蘭，王立芹，等.楊樹腫干潰瘍病病原菌的分離和鑒定[J].山東林業(yè)科技，2009（4）：31-35.

[6]邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學(xué)[M].北京:中國林業(yè)出版社，1984.