上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況

李自然， 施春雷， 宋明輝， 史賢明*

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240)

上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況

李自然， 施春雷， 宋明輝， 史賢明*

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240)

采集上海市食品樣品(生牛乳、生鮮肉、水產(chǎn)品、速凍食品、果蔬、豆制品)505份，按國標GB 4789.10ü 2010《金黃色葡萄球菌檢驗》方法進行金黃色葡萄球菌的分離和鑒定，并利用PCR技術(shù)進行進一步驗證。結(jié)果表明：505份食品樣品中有117份檢出了金黃色葡萄球菌，總檢出率為23.2%，其中生鮮肉檢出率最高，為32.9%；其次為生牛乳和速凍食品，分別為26.3%和26.7%；其他食品中金黃色葡萄球菌的檢出率相對較低。該實驗結(jié)果基本上反映了上海市各類食品中金黃色葡萄球菌的分布狀況，為監(jiān)控金黃色葡萄球菌引起的食物中毒及追溯污染源提供參考。

金黃色葡萄球菌；分離鑒定；食品；多聚酶鏈式反應(yīng)

金黃色葡萄球菌是重要的食源性及醫(yī)源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，它產(chǎn)生的腸毒素是引起食物中毒的主要致病因子，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒是世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。由于金黃色葡萄球菌對各種理化因素都有較強的抵抗力，且易污染肉類、乳品等食品，所以無論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中均占較大比例[2]。在我國，20%～25%的細菌性食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌引起的，成為僅次于沙門氏菌和副溶血弧菌的第三大致病菌[3]，已引起我國衛(wèi)生防疫和進出口檢驗等部門的廣泛重視。

為了有效防控金黃色葡萄球菌的污染，首先需要調(diào)查了解各類食品中金黃色葡萄球菌的分布規(guī)律，為此，本研究從上海市采集各類食品樣品，用國標GB 4789.10ü 2010《金黃色葡萄球菌檢驗》從中分離金黃色葡萄球菌，并利用PCR方法對其進行進一步鑒定，以了解該菌在食品中的分布情況，從而為監(jiān)控金黃色葡萄球菌引起的食物中毒及追溯污染源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2010年8月到2011年1月共采集食品樣品505份，其中生牛乳240份，采自上海市郊奶牛場，其余265份樣品(包括生鮮肉70份、速凍食品45份、水產(chǎn)品25份、果蔬80份、豆制品45份)采自上海市各個超市及農(nóng)貿(mào)市場。

無菌脫纖維羊血 上?？禎櫳锟萍加邢薰?；新鮮兔血漿 廣州蕊特生物科技有限公司；革蘭氏染液本實驗室自制；nuc1引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Taq酶、dNTPs 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31RTSF型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；恒溫混勻器、AG 2231 Hamburg型PCR儀 德國Eppendorf公司；DYCP-33A型電泳槽 北京市六一儀器廠；EPS 2A 200型電泳儀 美國Harvard Hoefer公司；GIS 2020型凝膠成像系統(tǒng) 廈門億辰科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯(BHI)、TSB固體培養(yǎng)基，均為本實驗室自制。

1.4 標準菌株

金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.5 金黃色葡萄球菌的分離及鑒定

1.5.1 前增菌

按照GB4789.10ü2010方法進行，稱取25g樣品至盛有225mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min；若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶中，振蕩混勻。將上述樣品勻液于(36f1)℃培養(yǎng)18～24h，金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。

1.5.2 分離培養(yǎng)

將上述培養(yǎng)物分別劃線接種到 Baird-Parker平板和血平板，血平板(36f1)℃培養(yǎng)18～24h，Baird-Parker平板(36f1)℃培養(yǎng)18～24h或45～48h。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈；在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶實驗。

1.5.3 鑒定

染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽孢，直徑約為0.5～1μm。

血漿凝固酶實驗：挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，(36f1)℃培養(yǎng)18～24h。取新鮮配制兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2～0.3mL，振蕩搖勻，置(36f1)℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每30min觀察1次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶實驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，(36f1)℃培養(yǎng)18～48h，重復(fù)上述實驗。

1.6 PCR方法驗證

由于一些非金黃色葡萄球菌菌株可能會產(chǎn)生活性很高的假凝固酶，產(chǎn)生凝血現(xiàn)象，從而導(dǎo)致假陽性[4]，所以本研究采用PCR技術(shù)擴增耐熱核酸酶基因(nuc1[5])的方法對疑似菌株進行進一步驗證，以減少假陽性。nuc1基因編碼的耐熱核酸酶具有較高的保守性[6]，且為金黃色葡萄球菌所特有[7]。引物nuc1由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列(5’→3’)上游：AGTATATAGTGCAACTTCAACTAA；下游：ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT。

PCR反應(yīng)體系為20μL，包括緩沖液2μL、引物(上下游)0.8μL、dNTP 0.8μL、Taq DNA聚合酶(天根2.5U/μL)0.4μL、Mg2+1.3μL、ddH2O 13.7μL、DNA模板1μL；循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、55℃復(fù)性30s、72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像分析儀中觀察擴增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的分離及鑒定

金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度[8]。本實驗中有一些菌落周圍沒有混濁圈，尤其是肉中分離的菌株，這與Capita等[9]的報道相符。

疑似分離株鏡檢結(jié)果為：革蘭氏染色陽性，呈單個短鏈或葡萄串狀排列，無鞭毛、無芽孢，符合金黃色葡萄球菌菌落的典型性狀。

在血平板上，形成的菌落較大，圓形、光滑凸起、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見完全透明溶血圈。本實驗中大部分為白色菌落，少數(shù)為金黃色，且不同菌株的溶血圈大小不同，這與其溶血能力有關(guān)，同時受血平板質(zhì)量的影響也很大。將相同的菌株接種于不同批次的血平板上，其溶血圈的大小不同。此外，通過實驗還發(fā)現(xiàn)血平板的厚度也是一個影響因素，厚度薄的平板的溶血帶更清晰[10]。所以本實驗以標準菌株ATCC6538接種血平板做為陽性對照，以減少因血平板質(zhì)量問題而出現(xiàn)漏檢情況。

在血漿凝固酶實驗中，根據(jù)國標規(guī)定，將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。本實驗中，有些菌株凝固的牢固，有些出現(xiàn)半凝現(xiàn)象，具有一定的流動性，難以進行準確判斷。為減少假陽性，需對可疑菌株進行PCR鑒定。

圖1為部分金黃色葡萄球菌菌株的PCR鑒定結(jié)果，生化反應(yīng)呈陽性的菌株中，有2株(來源于蔬菜)沒有出現(xiàn)陽性擴增，被證實為非金黃色葡萄球菌，其余分離株均擴增出nuc1特異性目的片段。可見，不能僅憑借血漿凝固酶實驗來鑒定金黃色葡萄球菌，否則可能會出現(xiàn)假陽性。

圖 1 金黃色葡萄球菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identif i cation of S. aureus by PCR

2.2 金黃色葡萄球菌在各類食品樣品中的污染狀況

經(jīng)過前增菌，選擇性培養(yǎng)基(Baird-Parker培養(yǎng)基、血瓊脂平板)分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、血漿凝固酶實驗以及PCR鑒定nuc1基因后，505份食品樣品中共有117份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為23.2%。各類食品中金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果見表1。

表 1 6類食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢出結(jié)果Table 1 Results of detection of Staphylococcus aureus in six food samples

2.2.1 生牛乳的污染狀況

由表1可見，240份生牛乳樣品(均采自上海市郊奶牛場，于不同時間采集不同奶牛而得)中有63份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為26.3%，與文獻[11]報道的我國生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為15%～38%相符。生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率之所以高，原因是很多奶?；加须[性乳房炎。有報道[12]稱我國奶牛隱性乳房炎的陽性率在46.4%～85.7%之間，而金黃色葡萄球菌又是引起乳房炎的重要病原菌[13]；此外，擠奶時消毒不徹底造成的二次污染也是造成高檢出率的原因之一。

2.2.2 生鮮肉的污染狀況

由表1可見，70份生鮮肉樣品中，有23份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為32.9%。70份樣品中有40份來自農(nóng)貿(mào)市場，10份呈陽性，檢出率為25.0%；30份來自超市，13份呈陽性，檢出率為43.3%，衛(wèi)生條件較差的農(nóng)貿(mào)市場的檢出率顯著低于超市的檢出率，這與索玉娟等[14]的研究結(jié)果相同。分析原因可能是由于農(nóng)貿(mào)市場雜菌較多，金黃色葡萄球菌的生長受到了抑制，還有待于進一步的分析。

2.2.3 速凍食品的污染狀況

由表1可見，45份速凍食品中，有12份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為26.7%。一般認為金黃色葡萄球菌受冷凍的影響，會產(chǎn)生亞致死性損傷，從而影響其存活與檢出[15]。然而，也有報道[16]稱金黃色葡萄球菌在冰棍中可存活2a以上，在模擬冰淇淋中可存活7a之久?？梢娊瘘S色葡萄球菌一旦污染速凍食品，便有可能長時間存活，從而導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生。

2.2.4 其他種類食品的污染狀況

水產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的檢出率為16%(4/25)，檢出的4份樣品分別為對蝦、帶魚、鯽魚和扇貝。

豆制品中金黃色葡萄球菌的檢出率為8.9%(4/45)，檢出的4份樣品分別為豆皮、綠豆糕、素雞和腐竹。

果蔬產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的檢出率為13.8%(11/80)，這些樣品大部分采自農(nóng)貿(mào)市場及超市，接觸人手的機會比較多；有些水果采自路邊水果攤，容易受灰塵污染，這些都可能是造成金黃色葡萄球菌檢出率較高的原因[11]。

綜上所述，生鮮肉檢出率最高，為32.9%；其次為速凍食品和生牛乳，分別為26.7%和26.3%；水產(chǎn)品、果蔬以及豆制品檢出率較低，分別為16.0%、13.8%和8.9%。

3 討 論

金黃色葡萄球菌作為一種常見的食源性致病菌，按國標規(guī)定，在食品中不得檢出，但本實驗中多種食品檢出金黃色葡萄球菌，且檢出率相對較高。此外，金黃色葡萄球菌腸毒素是造成金黃色葡萄球菌食物中毒的重要致病因子，最近研究表明，金黃色葡萄球菌腸毒素的類型有21種[17]，而且攜帶率很高，存在一定的安全隱患，不容忽視，我們應(yīng)采取防范措施，將食品安全風(fēng)險降至最低。

食品污染金黃色葡萄球菌的途徑很多，如食品加工人員個人衛(wèi)生不合格或操作不當(dāng)而污染食品；包裝不嚴，運輸過程中受到污染等。有些食品要引起特別注意，如生鮮肉及速凍食品，其檢出率比較高，特別是速度食品，一旦污染有可能長期存活。為此，做好防范措施就顯得尤為重要，如加工過程中注意個人衛(wèi)生，戴消毒口罩、一次性手套；減少流通領(lǐng)域的污染；食物盡量煮熟吃等。

本實驗中生牛乳樣品量較大，可將除生牛乳以外的其他樣品作為一個整體，同其進行比較。240份生牛乳樣品中，有63份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為26.3%；其他265份樣品有54份檢出金黃色葡萄球菌，檢出率為20.4%，與生牛乳樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率沒有顯著性差異。

果蔬、豆制品和水產(chǎn)品的檢出率雖然較低，但這些一般被認為是較衛(wèi)生的食品，也能檢出金黃色葡萄球菌，應(yīng)當(dāng)引起我們的注意，否則會導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生。

[1] le-LOIR Y, BARON F, GAUTIER M. Staphylococcus aureus and food poisoning[J]. Genetics and Molecular Research, 2003, 2(1): 63-76.

[2] FISCHER A, FRANCOIS P, HOLTFRETER S, et al. Development and evaluation of a rapid strategy to determine enterotoxin gene content in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 77(2): 184-190.

[3] 高濤. 食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J]. 福建分析測試, 2003, 12(2): 1775-1781.

[4] PETER H, SNEATH A, NICHOLAS S, et al. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. USA: Willizms, 1986: 1018.

[5] 唐俊妮, 周銳, 史賢明, 等. 金黃色葡萄球菌核酸酶基因缺失突變株RN4220Δnuc1的構(gòu)建[J]. 中國生物工程雜志, 2008, 28(11): 43-47.

[6] BRAKSTAD O G. Detection of Staphylococcus sureus by polymerase chain reaction amplif i cation of the nuc gene[J]. J Clin Microbiol, 1992, 30(7): 1654-1660.

[7] BRAKSTAD O G, MAELAND J A. Generation and characterization of moloclonal antibodies against Staphylococcus aureus[J]. Acta Pathol Microbiol Immunoi Seand, 1989, 92(2): 166.

[8] 食品安全國家標準評審委員會. GB4789.10ü2010 食品安全國家標準[S]. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部, 2010.

[9] CAPITA R, ALONSO-CALLEJA C, GARCIA-FERNANDEZ M C, et al. Characterization of Staphylococcus aureus isolated from poultry meat in Spain[J]. Poultry Science, 2002, 81: 414-421.

[10] 雷云瑞, 柴文平, 解立滿, 等. 廊坊市食品中金黃色葡萄球菌的檢測及污染狀況分析[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2009, 46(1): 100-104.

[11] 楊紅, 劉桂華, 龔云偉, 等. 食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況及檢測方法[J]. 中國衛(wèi)生工程學(xué), 2006, 5(2): 107-108.

[12] 周利青. 奶牛乳房炎的研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2005(5): 8-9.

[13] MINOR T E. Staphylococcus aureus and staphylococal food intoxication, a review Ⅲ. staphylococci in dairy foods[J]. J Milk Food Technol, 1972, 35(2): 77-82.

[14] 索玉娟, 于宏偉, 凌巍, 等. 食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究[J].中國食品學(xué)報, 2008, 8(3): 88-93.

[15] 孟昭赫. 食品衛(wèi)生檢驗方法注解微生物學(xué)部分[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1990: 860-865.

[16] 徐景野, 傅小紅, 張思敏, 等. 冷凍狀態(tài)下微生態(tài)中金黃色葡萄球菌的存活極限觀察[J]. 中國醫(yī)學(xué)檢驗雜志, 2002, 2(2): 107-108.

[17] MARIA-ANGELES A, MARIA-CARMEN M, MARIA-ROSARIO R. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins[J]. Toxins, 2010, 2: 1751-1773.

Distribution Status of Food-borne Staphylococcus aureus in Shanghai

LI Zi-ran，SHI Chun-lei，SONG Ming-hui，SHI Xian-ming*
(MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety, BorS. Luh Food Safety Research Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

In this study, Staphylococcus aureus was isolated and identif i ed from 505 food samples (including raw milk, raw meat, fruits, vegetables, aquatic products, frozen foods and soybean products) collected in Shanghai according to GB4789.10ü2010. In addition, PCR was performed for further conf i rmation. Staphylococcus aureus was detected in 117 food samples, with a total detection rate of 23.2%. The highest detection rate (32.9%) of Staphylococcus aureus in raw meat was found followed by frozen foods (26.7%) and raw milk (26.3%). In addition, the detection rates of Staphylococcus aureus in fruits and vegetables, aquatic products and soy products were lower than 16%. These results revealed the basic distribution status of Staphylococcus aureus in some types of foods in Shanghai, which may provide clues for monitoring Staphylococcus aureus in food processing, controlling food poisoning and tracing pollution sources.

Staphylococcus aureus；isolation and identif i cation；food；PCR

TS201.6

A

1002-6630(2013)01-0268-04

2011-11-14

科技部國際合作項目(2011DFA31220)；國家863計劃項目(SS2012AA101001)

李自然(1985ü)，男，碩士研究生，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：linature@163.com

*通信作者：史賢明(1961ü)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：xmshi@sjtu.edu.cn