蟬花蟲草中核苷類成分的分離純化和鑒定

陳安徽，陳宏偉，徐 洋，卓 濤，邵 穎*

(徐州工程學(xué)院食品生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

蟬花蟲草中核苷類成分的分離純化和鑒定

陳安徽，陳宏偉，徐 洋，卓 濤，邵 穎*

(徐州工程學(xué)院食品生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

對蟬花蟲草子實體中的核苷類成分進(jìn)行分離純化，并對獲得的組分進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：采用65%乙醇超聲波法提取的蟬花蟲草子實體提取物于10000r/min離心5min后，經(jīng)反相HPLC制備液相制備(色譜條件為：流動相為0～100%甲醇，梯度洗脫，洗脫速率為15mL/min，進(jìn)樣量1mL，檢測波長260nm)，分離得到6種主要化合物，經(jīng)鑒定，6種化合物均為核苷類產(chǎn)品，分別為胞嘧啶、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和蟲草素。對6種化合物進(jìn)行純度驗證，結(jié)果表明，6種化合物的純度均在95%以上，說明采用反相HPLC分離制備蟬花蟲草中的核苷類成分方法是可行的，并且該方法簡便、準(zhǔn)確。

蟬花；核苷；分離純化；鑒定

蟬花(Cordyceps cicadae)隸屬真菌門、子囊菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是一種具有保健功能的大型藥食兩用真菌，亦是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，富含多糖、核苷、甘露醇、麥角甾醇等多種活性物質(zhì)[1-2]。許多學(xué)者對蟬花生理活性及其活性成分進(jìn)行過廣泛研究。如劉森琴等[3]研究發(fā)現(xiàn)，人工蟬花的蟲草酸含量和野生蟬花相當(dāng)，蟲草多糖含量則高達(dá)110.09mg/g，腺苷含量較野生蟬花低，蟲草素未能檢出，但4種活性成分總量是野生蟬花的1.55倍。周俐斐等[4]采用水提醇沉法提取水溶性粗多糖，經(jīng)Sevag法除蛋白、透析和活性炭脫色制備得到蟬花總多糖，采用苯酚硫酸法測定多糖含量，發(fā)現(xiàn)該系列純化方法能有效地去除核酸、蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)等雜質(zhì)成分，使蟬花總多糖的含量達(dá)到50%以上，且苯酚-硫酸法測定蟬花總多糖含量簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。Odier等[5]發(fā)現(xiàn)一種蟬擬青霉培養(yǎng)物中具有抗菌和免疫抑制作用的多球殼菌素Myriocin。另外，藥理學(xué)研究還表明蟬花蟲草具有鎮(zhèn)靜催眠、提高免疫、抗菌、降低血糖等多種藥理活性[6-11]。

雖然對蟬花蟲草及其無性型蟬擬青霉的相關(guān)研究已有較多的報道，但尚未見對蟬花蟲草中核苷類成分的系統(tǒng)研究報道。本研究對采集自浙江省的野生蟬花蟲草的65%乙醇提取物中的核苷類成分進(jìn)行分離純化，并對獲得的成分進(jìn)行初步鑒定，為蟬花蟲草中核苷類活性物質(zhì)的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)研究及其相關(guān)食品、保健品、藥品等的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

蟬花野生蟲草子實體由徐州恒源生物工程有限公司提供。

1.1.2 試劑與儀器

核苷類標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；無水乙醇為國產(chǎn)分析純；甲醇、乙腈為國產(chǎn)色譜純。

TUMEN TL-15高速離心機(jī) 吉林圖們離心機(jī)廠；梅特勒AE200型電子天平 上海分析儀器廠；SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)公司；高效硅膠板GF254青島海洋化工廠分廠；5μm ODS2分析柱(4.6mmh250mm)、5μm ODS2反相C18制備柱(20mmh250mm) 美國Waters公司；UV730D檢測器、SP930高壓泵、Autochro化學(xué)工作站 韓國Younglin公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及樣品的準(zhǔn)備

準(zhǔn)確稱取200g樣品粉碎(過60目篩)，置于2000mL廣口瓶中，加入1000mL 65%乙醇溶液超聲波浸提(功率550W，頻率40kHz)30min，過濾取上清液，溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，配成適當(dāng)濃度溶液進(jìn)行反相HPLC分析制備。

分別準(zhǔn)確稱取腺苷、尿苷、鳥苷、肌苷、胞苷、胸苷、腺嘌呤、蟲草素各0.0100g，置于10mL的容量瓶，用65%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取適量上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用65%乙醇稀釋成一系列濃度的溶液，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的分離與制備

將樣品溶解于適量的甲醇(色譜純)中，通過反相HPLC進(jìn)行制備。色譜條件為：0～100%甲醇，梯度洗脫；分析時洗脫速率1mL/min，進(jìn)樣量20μL；制備時洗脫速率為15mL/min，進(jìn)樣量1mL；檢測波長260nm。

樣品收集：按峰收集。收集到的各個組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃減壓濃縮后用反相HPLC方法在不同洗脫梯度及不同波長條件下進(jìn)行收集。

1.2.3 核苷類成分的純度驗證及鑒定

取純化后的樣品配制成0.1mg/mL的甲醇溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。電離方式為ESI：正離子4000V，碎片能量215，負(fù)離子電壓—3500V，碎片能量175，干燥氣溫度均為300℃，噴嘴氣壓30psi，氣流10L/min。DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描。根據(jù)高分辨HPLC-MS得到的精確分子質(zhì)量及分子式，從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中搜索，得到其有關(guān)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)式。如果活性化合物與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的高效薄層色譜、HPLC及UV圖譜進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其Rf值、保留時間及紫外圖譜特征完全一致，即可初步判斷化合物與標(biāo)準(zhǔn)品為同種成分，則不進(jìn)行HPLC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花蟲草子實體提取物的反相HPLC分析

將蟬花蟲草子實體的提取物用65%乙醇配成1mg/mL的溶液，進(jìn)行反相HPLC分析。分析結(jié)果如圖1所示。

圖 1 蟬花蟲草子實體提取物的反相HPLC 圖Fig.1 HPLC prof i le of nucleoside extract

高效液相色譜分析過程中，在同一色譜條件下，不同物質(zhì)的出峰時間不同，同一物質(zhì)在不同波長條件下產(chǎn)生的色譜峰面積大小也不相同，因而可以依據(jù)色譜峰的出峰保留時間初步判斷化合物的種類。由圖1可以看出，在本色譜條件下，各組分間樣品分離情況較好，提取物色譜圖中有6個主要色譜峰，這說明提取物中含有6種主要成分。

2.2 樣品的分離制備

根據(jù)2.1節(jié)的分析結(jié)果，將提取物配成100mg/mL的樣品液進(jìn)行反相HPLC制備，進(jìn)樣量為1mL，分別收集保留時間10.1000、18.1833、28.3000、34.7667、37.2833、47.2500min色譜峰處的洗脫相，為保證樣品的純度，分別收集各洗脫峰中間的洗脫相，出峰初期和后期均不收集，連續(xù)制備10次，收集各洗脫相，相同保留時間的洗脫相合并收集到的樣品，根據(jù)出峰先后順序依次將樣品標(biāo)記為樣品1～6。

2.3 樣品的純度驗證

圖 2 樣品1～6的反相HPLC圖Fig.2 HPLC prof i les of samples 1 through 6

由圖2可知，經(jīng)過不同的洗脫條件和波長檢測條件下進(jìn)行反相HPLC分析，其中樣品2、3、4、5的色譜圖上均只出現(xiàn)一個主峰，初步判定該4種樣品為單一成分。樣品1和樣品6在260nm波長條件下，兩樣品在色譜圖上除一主峰外均有雜峰出現(xiàn)，說明這兩組分不純。對樣品1和樣品6進(jìn)行進(jìn)一步制備，直至在不同條件下色譜圖上均出現(xiàn)單一色譜峰。

分別對分離得到的6種樣品的液相色譜圖進(jìn)行積分，得出峰面積積分表，分別考察各樣品的峰面積百分比，計算各樣品的純度。研究結(jié)果表明樣品1～6的百分含量分別為98.89%、99.15%、97.99%、98.96%、99.32%和98.68%，這說明通過HPLC多次制備，即可獲得純度較高的分離樣品。

2.4 樣品的鑒定

將樣品液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在同等條件下進(jìn)行反相HPLC分析，通過比較保留時間和樣品液中加標(biāo)樣確認(rèn)待測成分的峰位，初步判斷樣品的種類。通過比較分析發(fā)現(xiàn)樣品2、3、4在同等色譜條件下，保留時間分別與腺嘌呤、肌苷、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間完全一致，對此3種樣品的高效薄層色譜、UV圖譜進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其Rf值、紫外圖譜特征完全一致，故判斷樣品2、3、4分別為腺嘌呤、肌苷、鳥苷。在研究過程中發(fā)現(xiàn)樣品1、5、6保留時間分別與尿苷、腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相近，但不完全一致。在樣品液中分別加入保留時間相近的標(biāo)樣進(jìn)行反相HPLC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜圖上均只有一條主峰出現(xiàn)。為進(jìn)一步確定3種樣品的種類，對3個樣品進(jìn)行進(jìn)一步的HPLC-MS分析。

樣品1對應(yīng)的色譜圖上有一個色譜峰，其MS陰離子圖譜中有較強(qiáng)的離子峰。陰離子僅有質(zhì)荷比為243.0652的峰，它對應(yīng)的分子式是C9H11N2O6(誤差為2.09h10—6)，其對應(yīng)的峰應(yīng)該是(M—H)—峰。從其紫外光譜圖上可看到，該化合物的特征吸收波長為260nm。由陰離子質(zhì)譜圖，可知該化合物的準(zhǔn)確分子式為C9H12N2O6。根據(jù)其分子式和紫外吸收性質(zhì)，并經(jīng)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，該化合物與已報道的尿苷分子式完全一致。綜合考慮樣品1與尿苷的高效薄層色譜及UV圖譜進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其Rf值及紫外圖譜特征完全一致。因此，鑒定樣品1為尿苷。

樣品5的MS陰離子色譜圖上有一個色譜峰，陰離子質(zhì)荷比為266.0897，對應(yīng)的分子式為C10H12N5O4(誤差0.83)，經(jīng)計算其對應(yīng)的峰應(yīng)該是(M—H)—峰。綜合考慮樣品5與腺苷的高效薄層色譜、反相HPLC及UV圖譜的比較分析結(jié)果，鑒定樣品5為腺苷。

在保留時間13.01min處對應(yīng)有兩個較強(qiáng)離子峰，質(zhì)荷比分別為134.0475、250.0946，雜質(zhì)峰信號很弱，通過對陰離子圖譜的分析，可知m/z 250.0946的峰為化合物的(M—H)—峰，m/z 134.0475的峰為化合物的(M—H—R)—峰，經(jīng)軟件計算可知m/z 250.0946峰對應(yīng)的分子式為C10H12N5O3，誤差為0.51h10—6。

在保留時間13.01min處對應(yīng)有3個離子峰，質(zhì)荷比分別136.0730、252.1192、274.1007，通過對陽離子圖譜的分析可知，m/z 252.1192的峰為化合物的(M+H)+峰，m/z 136.0730的峰為化合物的(M+H—R)+峰，m/z 274.1007的峰為化合物的(M+Na)+峰，經(jīng)計算可知252.1192峰對應(yīng)的分子式為C10H12N5O3，誤差為7.4h10—7，因此該化合物的相對分子質(zhì)量為251，且分子式為C10H13N5O3，與蟲草素分子式相同；從液相色譜圖來看，在全波長掃描的條件下，僅有一個峰，說明樣品6中只有一個具紫外吸收的化合物，為純品；在樣品6的紫外吸收光譜圖上可見樣品在260nm波長處有最大吸收峰，與蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品相同，進(jìn)一步證明該樣品為純度很高的蟲草素。

3 討 論

核苷類物質(zhì)特別是腺苷為蟲草的主要功效成分之一，在我國藥典中就以腺苷含量的高低作為蟲草制品的質(zhì)控指標(biāo)。文獻(xiàn)[12-20]報道腺苷主要具有舒張血管、降低血壓、減慢心率、抑制血小板聚焦、松馳血管平滑肌、改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸活化酶活性等的重要藥理作用，且該物質(zhì)廣泛存在于蟲草真菌的代謝與生物合成中。但野生蟲草及其無性型菌株發(fā)酵菌絲體間的腺苷含量，以及不同蟲草間的腺苷含量及種類均有所差異。如劉波等[21]研究了包含蛹擬青霉、蟬擬青霉、粉被瑪利亞霉、細(xì)腳擬青霉及古尼擬青霉在內(nèi)的5種蟲草無性型發(fā)酵菌絲體中的腺苷類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)5種蟲草菌株均能產(chǎn)出腺苷和腺嘌呤，但在蛹草擬青霉菌株中含有蟲草菌素，在粉被瑪利亞霉和蟬擬青霉菌株中含有N6-(2-羥乙基)腺苷。葛飛等[2]對天然蟬花及其無性型菌株-蟬擬青霉液體發(fā)酵菌絲體中的核苷含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)人工發(fā)酵菌絲體中的核苷類物質(zhì)含量明顯高于天然蟬花。

蟲草在臨床上的補(bǔ)益、增強(qiáng)免疫功能、輔助治療等作用，似乎與其富含多種核苷類物質(zhì)有著必然的聯(lián)系。有效成分的研究是蟲草資源開發(fā)的基礎(chǔ)，如何提取并純化其中的有效成分，以及如何檢驗這些成分的藥理作用，也是十分重要的研究工作。在本研究選定的色譜條件下，蟬花蟲草的65%甲醇提取物，采用反相制備HPLC，以甲醇和水為流動相，經(jīng)簡單的梯度洗脫，即可獲得純度在95%以上的核苷類化合物，該分離方法快速、準(zhǔn)確、操作簡單，表明該方法是一種快速分離蟲草中核苷類成分的現(xiàn)代制備方法。

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Purif i cation and Identif i cation of Nucleoside Components in Cordyceps cicadae Fruit Bodies

CHEN An-hui，CHEN Hong-wei，XU Yang，ZHUO Tao，SHAO Ying*
(Department of Food and Biology, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The aim of this study was to extract, purify and identify nucleoside components of Cordyceps cicadae fruit bodies. Samples were extracted with 65% ethanol by ultrasonic-assisted extraction, and a supernatant was obtained from the resulting extract by centrifugation at 10000 r/min for 5 min and separated by RP-HPLC using 0ü100% methanol as a mobile phase through gradient elution at a fl ow rate of 15 mL/min (1 mL injection volume, 260 nm detection wavelength). As a result, 6 fi nal products were obtained and identif i ed as cytosine, uridine, inosine,guanosine, adenosine and cordycepin, respectively, with a purify exceeding 95%. This study demonstrates that RP-HPLC is a feasible, simple and accurate technique for separating and preparing nucleoside components of Cordyceps cicadae fruit bodies.

Cordyceps cicadae；nucleoside；purif i cation；identif i cation

Q93.331

A

1002-6630(2013)01-0131-04

2012-06-30

江蘇省科技計劃項目(BN2011017；BN2011022)；國家星火計劃項目(2010GA730017)

陳安徽(1979—)，男，副教授，博士，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：chenah201@163.com

*通信作者：邵穎(1979ü)，女，講師，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：shyzhbo2005@126.com