DUSP9真核表達載體的構(gòu)建及其在Hepa1-6肝細胞中的表達＊

楊 艷，向加林，歐陽旭紅△，尹 玲，于國輝

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系2006級本科，貴州遵義563003）

DUSP9基因是近年研究發(fā)現(xiàn)具有雙重專一性的磷酸酶家族（Dual specificity protein phosphtases，DUSPs）成員之一。DUSPs可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激通路中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活性，因此，也稱作 MAPK磷酸 酶 家 族 （mitogen-activated protein kinase phosphatases，MKPs）。該家族屬于酪氨酸蛋白磷酸酶超家族，可通過去磷酸化、鈍化MAPK關(guān)鍵的酪氨酸和蘇氨酸殘基，調(diào)控MAPK的功能［1-2］。其家族成員因?qū)APKs家族表現(xiàn)出獨特的底物特異性，故分為DUSP1（又名 MKP1）、DUSP4（又名 MKP2）、DUSP6（又名 MKP3）、DUSP9（又名 MKP4）、DUSP10（又名MKP5）。研究發(fā)現(xiàn)，人源與小鼠DUSP9同源性為83%，在胎盤、肝、腎臟中高表達，且在發(fā)育進程中是可調(diào)型表達［3-4］，對胰島素作用存在爭議［2，5］，但其在胰島素抵抗進程中的作用機制及分子靶點尚未清楚。本研究通過構(gòu)建DUSP9真核表達載體，并在小鼠Hepa1-6肝細胞中過表達DUSP9，為進一步研究DUSP9生理功能及其在糖脂代謝、胰島素抵抗進程中的作用奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Hepa1-6肝細胞購自中科院上海細胞庫；pEGFPN1載體購于GENECHEM公司；DH5α購于大連寶生物公司。主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購自GIBICO公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；RNA提取試劑、DNA聚合酶PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP Mixture、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、Prime-ScriptTMRT reagent、引物、限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase等購自TAKARA公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小抽試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；兔抗小鼠β-actin一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司；兔抗鼠DUSP9購自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取及擴增 以健康C57小鼠肝組織總RNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，將得到的cDNA溶液應(yīng)用于PCR擴增。根據(jù)pubmed-GenBank中NM＿029352DUSP9mRNA序列，擴增小鼠DUSP9基因全編碼區(qū)cDNA片段，所用引物即上游：5′-CCG GAA TTC TAT GGA GAG TCT GAG TCG G-3′（含ECORI酶切位點）；下游：5′-CGG GTA CCG GTA GTG TGG GGT CCA GCT CAA AG-3′（含 AgeI酶切位點），PCR擴增反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性4min；98℃變性12s，64℃退火17s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃加長延伸6min，并純化PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組真核表達載體的構(gòu)建 分別用ECORI和AgeI雙酶切pEGFP-N1載體及目的基因片段并膠回收，T4DNA ligase 16℃連接過夜，第2天取10uL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α并將其涂布于含kanr的LB選擇性平板進行篩選，挑取陽性單克隆，置于含kanr的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒抽提，雙酶切鑒定并送大連寶生物公司測序。

1.2.3 Hepa1-6肝細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 （1）細胞培養(yǎng)：將 Hepa1-6肝細胞接種于6孔板，細胞密度確保第2天每孔能匯合80%，DMEM＋10%FBS培養(yǎng)（無雙抗），CO2細胞培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）孵育細胞。（2）細胞分組及轉(zhuǎn)染：將 Hepa1-6肝細胞分為3組，即陰性對照組（僅加入相對應(yīng)量的脂質(zhì)體和PBS的細胞，negative control group，NC組）、空載組（轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的細胞，blank control group，BC組）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pEGFP-DUSP9的細胞，transfection group，TG組），每組設(shè)平行實驗復(fù)孔（3孔），重復(fù)實驗2次。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體按1∶2.5與Opti-MEM混合進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說明書。

1.2.4 DUSP9mRNA表達水平的檢測 轉(zhuǎn)染48h后，分別提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ熒光染料實時定量PCR法檢測DUSP9mRNA的表達。以β-actin基因作為內(nèi)參，用2-△△CT值表示基因相對表達量。所用引物即 DUSP9上游：5′-GCT TCA GTG GTC GTG CC G-3′，DUSP9下游5′-GGA GGG GAT GTG GTG TTC-3′；小鼠β-actin上游引物：5′-GCT GTC CCT GTA TGC CTC T-3′，下游：5′-GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′。

1.2.5 DUSP9蛋白表達水平的檢測 采用 Western blot法檢測各組細胞DUSP9蛋白表達水平。提取各組細胞總蛋白，按每泳道加80ug蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（0.45μm），室溫封閉3h，一抗（內(nèi)參β-actin 1∶250，DUSP9 1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000稀釋）孵育1h并洗脫，將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光板，加入發(fā)光試劑，室溫反應(yīng)2min后置化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pEGFP-DUSP9重組真核表達質(zhì)粒酶切、測序鑒定結(jié)果

pEGFP-DUSP9質(zhì)粒經(jīng)ECORⅠ、AgeⅠ雙酶切，切出約4 700、1 359bp的片段，分別代表質(zhì)粒pEGFP-N1和插入目的片段DUSP9，與預(yù)期結(jié)果完全一致，說明DUSP9基因已正確克隆到pEGFP-N1表達載體。測序結(jié)果（部分見圖1）顯示與目的基因序列（NM＿029352）CDS區(qū)完全一致。

2.2 pEGFP-DUSP9轉(zhuǎn)染的驗證 倒置熒光顯微鏡下可見重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞發(fā)綠色熒光，見圖2。

圖1 重組質(zhì)粒DNA測序結(jié)果部分彩圖（紅色劃線部分表示克隆序列的起始位）

圖2 Hepa1-6細胞培養(yǎng)及pEGFP-DUSP9轉(zhuǎn)染圖

2.3 DUSP9過表達的驗證 RT-QPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，TG組肝細胞中，DUSP9mRNA表達量明顯上調(diào)，是NC組61.82倍（ΔCt值：11.18±0.35 vs 17.13±0.22，P＜0.01），其蛋白水平也呈高表達，NC、BC組中DUSP9蛋白表達較低，提示DUSP9質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hepa1-6肝細胞且高表達，見圖3。

圖3 Western blot檢測各實驗組Hepa1-6細胞中DUSP9的表達

3 討 論

胰島素抵抗（IR）是2型糖尿病（T2DM）發(fā)病的一個關(guān)鍵因素，其產(chǎn)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來隨著國內(nèi)外對IR的深入研究，氧化應(yīng)激學(xué)說、炎癥病因?qū)W說、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說相繼提出且成為IR的研究熱點，其相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)子等研究更為深入。

MAPK及應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinases，SAPK，）在IR發(fā)展進程中起著重要作用［6］，二者的作用靶點之一為胰島素傳導(dǎo)關(guān)鍵分子-胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1），均能使IRS-1絲氨酸殘基磷酸化［7］，降低IRS-1酪氨酸磷酸化水平，進而阻礙了它與胰島素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)下游元件的相互作用［8］，導(dǎo)致IR的發(fā)生。有趣的是MAPK及SAPK的激活是一個可逆的過程，阻斷這些應(yīng)激激酶可能阻止IR的發(fā)展。

DUSP9作為可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激通路中MAPK活性的雙重專一性磷酸酶家族成員，可鈍化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）及p38MAPK 的活性，但對SAPK的作用尚無定論，最新研究發(fā)現(xiàn)在惡性腎腫瘤透明細胞下調(diào)DUSP9的表達與疾病的預(yù)后不良有關(guān)聯(lián)［9］。其在IR進程中的作用也尚未明確。有研究認為，在3T3-F442A脂肪細胞中過表達DUSP9，可封閉胰島素誘導(dǎo)的脂質(zhì)形成及糖攝取，負向調(diào)節(jié)胰島素信號，可能促使了IR的發(fā)生［4］。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1細胞中過表達DUSP9，抑制ERK及JNK／SAPK的磷酸化以及在較小程度上抑制了p38MAPK磷酸化［2］。茴香霉素誘導(dǎo)的IRS-1絲氨酸磷酸化被終止，IRS-1酪氨酸磷酸化的信號路徑得以恢復(fù)，從而恢復(fù)了胰島素的敏感性，并且能逆轉(zhuǎn)腫瘤壞死因子-a（TNF-α）抑制的胰島素信號。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠白色脂肪可檢測到DUSP9的表達；肥胖小鼠體內(nèi)DUSP9在胰島素敏感組織特異性上調(diào)表達；3T3-F442A前脂肪細胞中DUSP9成低表達，在脂肪形成期表達上調(diào)［9］，說明DUSP9可能參與了促成熟脂肪細胞形成，或與脂質(zhì)形成相關(guān)。但其在代謝組學(xué)如對糖脂代謝、脂肪細胞因子的作用尚未見進一步研究報道。

因此，本實驗欲通過克隆DUSP9真核表達載體，并在胰島素敏感組織-肝細胞（Hepa1-6）中過表達DUSP9蛋白，為進一步探討DUSP9對糖脂代謝、脂肪細胞因子可能的作用及機制奠定研究基礎(chǔ)。本實驗中，利用pEGFP-N1質(zhì)粒（帶綠色熒光蛋白的報告載體）、采取雙酶切定向克隆的方式（避免自連和反向連接）構(gòu)建DUSP9重組真核表達載體。pEGFP-N1包含增強型綠色熒光蛋白基因EGFP，使得其在哺乳動物細胞中有較高的表達及較強的熒光得到最佳化，并為可應(yīng)用流式細胞篩選或其他方式對瞬時轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞表達EGFP及目的蛋白的有效率提供一個依據(jù)；含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達；結(jié)構(gòu)上，該質(zhì)粒具有很強的復(fù)制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨細胞質(zhì)遺傳給新生的子細胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達的因素之一；具有新霉素抗性（neo）基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細胞。此外，采用含Kanr的LB選擇性培養(yǎng)基篩選含Kanr轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，并經(jīng)雙酶切初步鑒定克隆正確，最后經(jīng)DNA測序分析確定所插入的目的基因片段的正確性。

本實驗成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-DUSP9，并在Hepa1-6肝細胞中高效表達DUSP9蛋白，有望成為IR發(fā)生的分子生物學(xué)治療靶點，同時也為T2DM的治療提供新的思路。

［1］Teng CH，Huang WN，Meng TC.Several dual specificity phosphatases coordinate to control the magnitude and duration of JNK activation in signaling response to oxidative stress［J］.J Biol Chem，2007，282（39）：28395-28407.

［2］Emanuelli B，EberléD，Suzuki R，et al.Overexpression of the dual-specificity phosphatase MKP-4／DUSP-9protects against stress-induced insulin resistance［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（9）：3545-3550.

［3］Christie GR，Williams DJ，Macisaac F，et al.The dual-specificity protein phosphatase DUSP9／MKP-4is essential for placental function but is not required for normal embryonic development［J］.Mol Cell Biol，2005，25（18）：8323-8333.

［4］Dickinson RJ，Williams DJ，Slack DN，et al.Characterization of a murine gene encoding a developmentally regulated cytoplasmic dual-specificity mitogen-activated protein kinase phosphatase［J］.J Biol Chem，2002，364（Pt 1）：145-155.

［5］Xu H，Dembski M，Yang Q，et al.Dual specificity mitogen-activated protein（MAP）kinase phosphatase-4plays a potential role in insulin resistance［J］.J Biol Chem，2003，278（32）：30187-30192.

［6］Hirosumi J，Tuncman G，Chang L，et al.A central role for JNK in obesity and insulin resistance［J］.Nature，2002，420（6913）：333-336.

［7］Aguirre V，Uchida T，Yenush L，et al.The c-Jun NH（2）-terminal kinase promotes insulin resistance during association with insulin receptor substrate-1and phosphorylation of Ser（307）［J］.J Biol Chem，2000，275（12）：9047-9054.

［8］Aguirre V，Werner ED，Giraud J，et al.Phosphorylation of Ser307in insulin receptor substrate-1blocks interactions with the insulin receptor and inhibits insulin action［J］.J Biol Chem，2002，277（2）：1531-1537.

［9］Wu S，Wang Y，Sun L，et al.Decreased expression of dualspecificity phosphatase 9is associated with poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma［J］.BMC Cancer，2011，11（413）：413.