烏司他丁對膿毒癥膈肌p38MAPK信號通路的影響＊

張紅梅，劉 培，盛春風(fēng)，鄭紅梅

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院：1.呼吸內(nèi)科；2.重癥醫(yī)學(xué)科；3.普外科，湖北十堰442000）

膿毒癥（sepsis）是重癥感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），進一步可發(fā)展成為多器官功能衰竭（MODS）［1］。在前期的研究中作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路可能是通過促進膈肌肌細胞凋亡機制來參與膿毒癥膈肌損傷，并且給予烏司他丁治療后膈肌損傷減輕，膈肌肌細胞凋亡率減少。為了進一步探討烏司他丁對膿毒癥膈肌p38MAPK信號通路的影響，本研究選用成年雄性SD大鼠制作盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）模型，觀察p38MAPK蛋白表達、肌細胞凋亡率及肌肉收縮力。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，由鄖陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。采用隨機化數(shù)字法，將大鼠隨機分為3組，A組（假手術(shù)組，n＝10）、B組（膿毒癥組，n＝10）及C組（烏司他丁治療組，n＝10）。

1.2 CLP模型的建立［2］將購來的SD大鼠在實驗室飼養(yǎng)1周以上，實驗前禁食24h，自由飲水。以10%水合氯醛（0.35 mL／100g）腹腔麻醉后固定。假手術(shù)組大鼠沿下腹部中線位置縱行切開長約2cm切口，尋找到盲腸后輕提起盲腸并將之回納入腹腔，不作任何處理，縫合傷口。B組大鼠在麻醉后切開左頸外動脈，留置導(dǎo)管，監(jiān)測平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP），記錄血壓基礎(chǔ)值。手術(shù)分層打開腹腔，尋找到盲腸后提起其末端，暴露回盲部以1.0絲線結(jié)扎盲腸遠端2／3部分，并用18號針穿刺盲腸2次，1孔在盲腸末端，1孔在盲腸近端，輕壓盲腸讓少量腸內(nèi)容物排至腹腔內(nèi)。然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后立即給動物皮下注射林格液50 mL／kg體質(zhì)量抗休克。手術(shù)完成后，觀察血壓值變化，當(dāng)所監(jiān)測血壓值下降幅度超過基礎(chǔ)值的20%且持續(xù)20min以上時，即可認為達到早期膿毒性休克標準，實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ?］。術(shù)后觀察大鼠的健康情況。

1.3 烏司他丁治療方法 C組大鼠在制作CLP模型后立即給予烏司他丁20 000U腹腔注射，并且于8h后再次給予烏司他丁20 000U腹腔注射。而A組不作任何處理，B組大鼠則在制作模型后立即及8h后給予生理鹽水2mL腹腔注射作為對照。

1.4 膈肌肌細胞凋亡率檢查 新鮮膈肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。用武漢博士德公司提供的原位細胞凋亡檢測試劑盒TUNEL法檢測膈肌細胞凋亡程度。

1.5 膈肌肌條收縮力檢測 處死動物后，剖腹速取左側(cè)肋膈肌，包括中心腱及肋骨，置于37.8℃，通有95%O2與5%CO2混合氣體的林格氏液浴槽中（pH 7.4）。將膈肌剪成5mm×15mm的肌條。肌條肋骨端固定在浴槽底部，中心腱端連接于經(jīng)過標化校對的張力換能器上，張力換能器連接于多道生理記錄儀。將肌條置于兩片鉑金電極間，采用刺激儀予以0.5ms單脈沖方波刺激（刺激參數(shù)前負荷：2g，時間常數(shù)：DC，高頻濾波：30Hz，增益：10g），每個刺激間隔2h。初始刺激強度為0.1mA，逐漸增大刺激強度，每次增加0.05mA，當(dāng)?shù)玫降募∪馐湛s力不再增大時獲得的收縮力為最大收縮力。肌條收縮力＝最大收縮力／肌條橫截面積，橫截面積＝肌條重量（g）／［肌條長度×肌肉密度（1.056g／cm3）］。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 假實驗組大鼠術(shù)后一般狀況良好，行動自如，呼吸平穩(wěn)，飲食正常。B組大鼠術(shù)后精神萎靡、行動遲緩、輕度豎毛、移動減少、喜靜臥、群聚減少。A組大鼠腹腔內(nèi)腸管正?；蛴猩倭空尺B，腸黏膜正?；蜉p度水腫、充血。B組大鼠腹腔內(nèi)有血性或膿性滲出液，帶惡臭，腸管脹氣，內(nèi)臟充血水腫失去原有光澤，腸黏膜充血水腫明顯。B組血壓值術(shù)后下降幅度超過基礎(chǔ)血壓值的20%且持續(xù)20min以上。而A組其血壓值術(shù)后沒有明顯下降。

2.2 p38MAPK蛋白表達、膈肌肌細胞凋亡率及膈肌收縮力檢測 制作膿毒癥模型后，B組膈肌肌條收縮力較A組明顯下降，肌細胞凋亡率及p38MAPK蛋白表達明顯上升。但給予烏司他丁治療后，雖然C組膈肌肌條收縮力仍較A組下降，肌細胞凋亡率及p38MAPK蛋白表達上升。C組膈肌肌條收縮力、p38MAPK蛋白表達及肌細胞凋亡率均較B組有改善，3個方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 3組大鼠p38MAPK蛋白表達、膈肌肌細胞凋亡率及膈肌收縮力比較（±s，n＝10）

表1 3組大鼠p38MAPK蛋白表達、膈肌肌細胞凋亡率及膈肌收縮力比較（±s，n＝10）

＊：P＜0.01，與A組比較；＃：P＜0.01，與B組比較。

組別 膈肌肌細胞凋亡率（%）p38MAPK蛋白平均灰密度（×10-3）肌條收縮力（N／cm2）×10-3 1.71±1.38 10.22±3.94 1 035.46±34.32 B組 25.16±2.71＊ 157.24±19.16＊ 174.87±28.83＊C組 14.42±1.03＊＃ 93.27±12.20＊＃ 300.59±19.94＊＃A組

2.3 膈肌病理切片 圖1所示A組膈肌結(jié)構(gòu)基本正常；圖2為制作膿毒癥模型16h后膈肌組織，組織水腫明顯，并有較多炎性細胞浸潤；圖3為烏司他丁治療后膈肌組織，組織水腫減輕，炎性細胞較前減少。

圖1 A組膈肌病理切片（HE，×400）

圖2 B組膈肌病理切片（HE，×400）

圖3 C組膈肌病理切片（HE，×400）

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時膈肌的收縮力明顯下降［4］。在本實驗中同樣也觀察到，制作CLP模型后膈肌收縮力明顯下降，只有A組的20%左右。而膈肌作為主要的呼吸肌，其收縮力下降又是膿毒癥患者長時間不能撤離呼吸機的主要原因之一［5］。因此，對膿毒癥膈肌損傷機制的研究對制定有效的防治措施、降低術(shù)后并發(fā)癥、死亡率、改善患者生存質(zhì)量及降低醫(yī)療成本，具有重要的意義。

MAPK信號通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，是介導(dǎo)細胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，參與了細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等［6］。p38信號通路是MAPK家族的重要組成成員，被認為屬于“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK。而p38MAPK促進凋亡的機制可能為：內(nèi)毒素激活p38MAPK信號通路后，p38可進一步使促凋亡激活轉(zhuǎn)錄因子-2磷酸化，核因子-κB從細胞液易位至細胞核，促使DNA斷裂，最終發(fā)生細胞的肥大和凋亡［7］。本研究觀察到隨著p38MAPK蛋白表達增加，膈肌肌細胞凋亡率也明顯增加。而膈肌中凋亡細胞數(shù)目的增加，有收縮功能的細胞百分比勢必下降，那么也必然會對收縮力產(chǎn)生影響。抑制p38MAPK信號通路對于改善膿毒癥膈肌損傷具有重要意義［8］。

烏司他丁是在人尿液中發(fā)現(xiàn)的尿胰蛋白酶抑制劑，能廣譜、高效移植多種蛋白酶、脂水解酶、糖水解酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放［9］，已廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭、改善器官缺血再灌注［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，制作膿毒癥模型后給予烏司他丁治療能夠明顯減少p38MAPK蛋白表達。并且在前期研究中作者發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠明顯減少膿毒癥時膈肌內(nèi)氧自由基釋放，降低SOD消耗。而氧自由基能夠作為第二信號增加p38MAPK蛋白表達，促進p38MAPK磷酸化［11］。因此，烏司他丁可能是通過減少氧自由基釋放、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)來抑制p38MAPK信號通路。

綜上所述，烏司他丁能夠有效抑制p38MAPK信號通路，減少膈肌肌細胞凋亡率，減輕膿毒癥膈肌損傷程度。因此，烏司他丁對于防治膿毒癥并發(fā)癥，降低死亡率，改善患者生活質(zhì)量有重要意義。

［1］Bhatia M，He M，Zhang H，et al.Sepsis as a model of SIRS［J］.Front Biosci，2009，14：4703-4711.

［2］Hubbard WJ，Choudhry M，Schwacha MG，et al.Cecal ligation and puncture［J］.Shock，2005，23（1）：52-57.

［3］齊宇潔，樊尋梅，周濤，等.不同劑量氫化可的松對早期膿毒性休克大鼠炎癥介質(zhì)分泌的影響［J］.中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2007，14（3）：235-238.

［4］Powers SK.Calpain and caspase-3are required for sepsisinduced diaphragmatic weakness［J］.J Appl Physiol，2009，107（5）：1369-1371.

［5］Montgomery AB，Stager MA，Carrico CJ，et al.Causes of mortality in patients with the adult respiratory distress syndrome［J］.Am Rev Respir Dis，1985，132（2）：485-489.

［6］Sasaki K，Chiba K.Induction of apoptosis in starfish eggs requires spontaneous inactivation of MAPK（extracellular signal-regulated kinase）followed by activation of p38MAPK［J］.Mol Biol Cell，2004，15（3）：1387-1396.

［7］Sharma，Avadhesh C.Spesis-induced myocardial dysfunction［J］.Shock，2007，28（3）：265-269.

［8］Guo W，Liu W，Chen G，et al.Water-soluble andrographolide sulfonate exerts anti-sepsis action in mice through down-regulating p38MAPK，STAT3and NF-kappaB pathways［J］.Int Immunopharmacol，2012，14（4）：613-619.

［9］Kim MS，Park JW，Lim YH，et al.Effect of ulinastatin on the rocuronium-induced neuromuscular blockade［J］.Korean J Anesthesiol，2012，62（3）：240-244.

［10］Shin IW，Jang IS，Lee SM，et al.Myocardial protective effect by ulinastatin via an anti-inflammatory response after regional ischemia／reperfusion injury in an in vivo rat heart model［J］.Korean J Anesthesiol，2011，61（6）：499-505.

［11］Hsieh CC，Papaconstantinou J.Thioredoxin-ASKl complex levels regulate ROS-mediated p38MAPK pathway activity in livers of aged and long-lived snell dwarf mice［J］.FASEB J，2006，20（2）：259-268.