中西藥復(fù)方制劑"復(fù)方龍膽散"防治青蛙肝炎和腹水癥的研究

王康文

（海南省屯昌縣畜牧獸醫(yī)局，屯昌 571600）

泰國虎紋蛙，原產(chǎn)于泰國，是繼美國青蛙之后引進的又一新的食用蛙品種，又名泰國青蛙，俗稱泥蛙、田雞、田蛙、水雞等，屬兩棲綱、無尾目、蛙科[1]。海南自1997年從泰國引種虎紋蛙以來，虎紋蛙的人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，現(xiàn)在已成為一個較大的產(chǎn)業(yè)。不過，隨著海南虎紋蛙養(yǎng)殖不斷發(fā)展，相關(guān)病害也越來越多，其中，由嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌引起的肝炎和腹水癥病癥尤為嚴重。該蛙病呈爆發(fā)性，來勢迅猛，正常進食的病蛙，一旦出現(xiàn)少數(shù)蛙死之后，在短短幾天內(nèi)，全池蛙死亡率可達60%以上，是一種惡性傳染病，危害極大，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失。由于從不同水體或同一水體不同時間分離到的病原菌對藥物敏感性有一定差異，治療難度較大。為了探討防治肝炎和腹水癥合適藥物，我們根據(jù)藥敏實驗篩選了系列對該病的病原有效治療的藥物，并對有關(guān)防治方法進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料的來源

1.1.1 患病虎紋蛙

由海南文昌市大致坡鎮(zhèn)、瓊海市長坡鎮(zhèn)、湖南等蛙場提供的患有腹水和肝炎癥的病蛙一批。

1.1.2 實驗設(shè)備

解剖剪刀、酒精燈、固定木板、鐵釘、手套、接種玻璃棒、接種鐵絲、平板、培養(yǎng)基等。

1.1.3 培養(yǎng)基制備

先將高壓滅菌過的空燒瓶中加入所要配制總量的50%左右的水，分別稱取牛肉膏3g、蛋白胨5g、瓊脂粉7g、酵母浸膏1g，然后用玻璃棒攪勻，再加熱溶解，定容。用1/10的NaOH調(diào)PH，用PH紙對照PH值為7.2，培養(yǎng)基即可使用，待降溫后放入冰箱低溫保存待用。

1.1.4 中西藥復(fù)方制劑

以龍膽、黃芩、甘草、柴胡等中藥材，并輔以抗菌藥物諾氟沙星和抗應(yīng)激劑維生素C等為基礎(chǔ)組方的護肝方劑“復(fù)方龍膽散”。用于保肝、護肝、殺菌和防治肝炎和腹水癥疾病。精選以上中藥材料經(jīng)粉碎，過80目篩，加入諾氟沙星等復(fù)配制備。

1.1.5 標準藥敏紙片

北京天壇藥物生技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號為20060203。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原的接種培養(yǎng)[2]

（1）腹水癥的病原接種 把培養(yǎng)基等所用器材準備好，將蛙固定在木板上，用剪刀將病蛙腹部皮膚剪開（在每次使用剪刀或者其他金屬器材前都將之放在火焰上微燒消毒），用接種鐵絲輕沾腹部流出的液體然后輕輕地涂在培養(yǎng)基表面上，做好記錄放入恒溫箱中恒溫（37.5℃）24小時后觀察病菌生長情況。（2）肝炎病原的接種培養(yǎng) 用剪刀把腹部皮膚完全剪開，用小剪刀把肝剪開一個小口，將接種鐵絲插入剪開的小口中，沾住肝中的黏液涂在培養(yǎng)基上并作好記號，放入恒箱培養(yǎng)24小時后觀察。

1.2.2 藥敏試驗

1.2.2.1 抗菌素紙片的制備

（1）將質(zhì)量較好的濾紙用打孔機打成直徑60mm的圓片，每100片放入一瓶中，高壓滅菌（1.02kg30min）后在60攝氏度條件下烘干。

（2）用無菌操作法將待測的抗菌藥物溶液1ml，加入100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡1-2h，立即試驗可不烘干，若保存?zhèn)溆每捎孟铝蟹椒ê娓桑ǜ稍锏目咕丶埰杀４?個月）①培養(yǎng)烘干法：將浸泡有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37℃箱內(nèi)保持2-3h即可干燥，或放在無菌室內(nèi)過夜干燥。②真空抽干法：將放有抗菌藥物紙片的試管，置于燥管內(nèi)，用真空抽氣機抽干。將制好的各種藥物紙片裝入無菌小瓶中，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。并用標準敏感菌株作敏感性試驗，記錄抑菌圈的直徑，若抑菌圈的的比標準敏感菌株的原來縮小，則表該抗菌藥物已失效，不能再用。

1.2.2.2 藥敏試驗操作

（1）用培養(yǎng)16-24h血平板上的菌落接種于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準。

（2）用無菌棉拭子蘸取少量的菌液，在M-H瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最好沿平板內(nèi)緣涂抹一周。

（3）將接種的平板置室溫下干燥3-5分鐘后，用無菌鑷子取含藥紙片緊貼于瓊脂表面，紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，置35攝氏度培養(yǎng)16-18h后觀察結(jié)果。

（4）24小時后取出所接種的病原觀察，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈一般抑菌圈是接近圓形的，抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory，MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大MIC愈小。

2 虎紋蛙肝炎和腹水癥的病原及發(fā)病流行特點

2.1 虎紋蛙肝炎 是由于感染嗜水氣單胞菌發(fā)病，不同規(guī)格的蛙均可發(fā)生，其特點是發(fā)病快，傳染性強，死亡率高，危害大。一般發(fā)生在春末、初夏和秋末，水溫15-30℃。該病主要癥狀是：病蛙外觀呈肥胖感，雙腿粗大，呈極淡紅色，手壓則有硬肌肉感，幼蛙皮膚在不同部位有潰瘍?nèi)睋p，形狀不規(guī)則，若氣溫較低，潰瘍處加大，甚至有肌肉腐爛狀。有的個體前后肢均有淡紅色出血感，解剖內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)，該病主要的病變在肝臟。肝異常腫大，可達正常肝的2倍左右，呈灰白色，膽腫大呈淺綠色，胃腸表面血管部分或全部充血，胃腸壁表面部分或全部充血發(fā)紅，胃腸內(nèi)有或無食物，具淡黃色黏膜。

2.2 虎紋蛙腹水癥 是由于感染遲鈍愛德華氏菌發(fā)病。癥狀：蛙傳染性肝病，簡稱“肝病”，也有的稱為大肚子病、鼓脹病、水腫病。發(fā)病時，病蛙精神不振，不攝食物，腹部膨脹、腫氣，后肢股部皮膚大塊狀充血，有的腹部兩前肢間出血，有數(shù)個小的血疙瘩，有的外表完好，不呈現(xiàn)任何特別明顯的傷口；有腹水，肝腫大，有的充血，有的有白色點狀壞死灶。胃壁樹枝狀充血，腸道充血，脾腫大，暗紅。發(fā)病蛙數(shù)日若得不到及時治療，將很快死亡。

2.3 危害程度：不論幼蛙或成蛙均可發(fā)生傳染性肝炎和腹水癥，嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌兩種病原同時感染發(fā)病，前期肝炎為主，后期腹水嚴重，難于治療，死亡率高達60%左右，且傳染性很強，一個養(yǎng)殖池中有蛙發(fā)病，若不及時撈出，采取積極措施，往往導(dǎo)致整池蛙都發(fā)病。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 觀察的結(jié)果如下表1、表2所示，抑菌圈用直徑/mm，敏感性用“-”“+”符號表示

表1 不同藥物對虎紋蛙腹水癥病原的抗菌活性

表2 不同藥物對虎紋蛙肝炎病原的抗菌活性

3.2 討論

3.2.1 虎紋蛙肝炎的剖檢與藥敏

從疑似病蛙解剖看到，虎紋蛙肝炎外觀癥狀不明顯，一旦發(fā)病，四肢無力，肌肉癱軟如一團稀泥，口腔有含血絲黏液吐出，并常伴有舌頭從口腔中吐出的現(xiàn)象。肝臟嚴重變色，或失色呈灰白色或土黃色，膽囊也腫大呈現(xiàn)淺綠色，胃腸充血明顯。腎臟有時也充充血腫脹。從發(fā)病到死亡一般為2～3天。死亡率極高。幼蛙發(fā)病后體表有不規(guī)則的潰瘍斑，四肢及腹部皮膚充血呈深紅色，肌肉呈現(xiàn)淡黃綠色。肝臟異常腫大，肝臟顏色呈灰白色，或嚴重充血呈墨綠色。膽汁濃，墨綠色。腸胃內(nèi)無食物，時有腸段套進胃[3]。通過藥物抗菌活性研究，阿米卡星，頭孢曲松鈉，氯霉素和“復(fù)方龍膽散”呈高度敏感（+++）；萬古霉素呈中度敏感（+++），其他藥物均低敏感或無敏感。

3.2.2 虎紋蛙腹水癥的剖檢與藥敏

從疑似病蛙解剖看到，癥狀表現(xiàn)為腹水明顯，腹部表面似有透明斑或斑點狀出血；眼球時有充血，腹水也是困擾人工養(yǎng)殖戶的一個重大問題之一 [4]，治療過程長，而腹水難于消除，死亡率也很高，更主要的是蛙的耐藥性越來越強，通過實驗分析，阿米卡星，頭孢曲松鈉、“復(fù)方龍膽散”呈高敏（+++）頭孢拉定呈中度敏感（++）；其他藥物低敏感或無敏感。

3.2.3 臨床治療結(jié)果

從蛙湯送來疑似病蛙，經(jīng)剖解初步判斷為肝炎和腹水癥，選用“復(fù)方龍膽散”進行混料投服，2次/日，用藥三天能控制病情，5-7天基本治愈或轉(zhuǎn)好。用中西藥復(fù)方制劑進行治療疑似病蛙11例，其中用8例治愈，2例好轉(zhuǎn)，1例沒有效果。

3.2.4 虎紋蛙肝炎和腹水癥的防治措施

肝炎和腹水癥由于其主要病變在肝、腎臟，中、后期病蛙造成水腫、腹水嚴重，治療難度大，應(yīng)以預(yù)防及早期治療為主。

預(yù)防措施[5]：

（1）不喂變質(zhì)的飼料，控制飼料中蛋白質(zhì)含量，避免蛙體氨中毒，而造成肝腎的損害。（2）不長期過量使用磺胺、紅霉素、鏈霉素等類藥物，影響肝、腎代謝功能。（3）定期在飼料中添加護肝類中藥制劑，檸檬酸鈉制劑消除腎腫，保護肝腎功能。（4）控制水質(zhì)，定期消毒。

治療措施：[6]

該病的治療以內(nèi)服藥和外用藥聯(lián)合使用效果最好。

外用藥：選用溴氯海因，聚維酮碘溶液、葵甲溴銨溶液任一種進行全池遍灑或沿食臺進行區(qū)域潑灑。

口服藥：選用“復(fù)方龍膽散”進行混料投服，2次/日，連用5天。

本研究表明，抗菌藥物阿米卡星、頭孢曲松鈉、氯霉素、諾氟沙星和“復(fù)方龍膽散”對嗜水氣單胞菌呈高度敏感（+++），均可用于防治蛙的肝炎和腹水癥，但由于阿米卡星、頭孢曲松鈉、氯霉素在水產(chǎn)動物中禁用，“復(fù)方龍膽散”既具有高敏的抗菌活性，而又能保肝、護肝，利于后期的恢復(fù)治療。經(jīng)臨床試驗，療效確實。故可推薦中西藥復(fù)方制劑“復(fù)方龍膽散”做為最佳選擇藥物。

[1]葉雪平.病蛙的診斷與防治技術(shù)（四）[J].水產(chǎn)科技情報，1999，26（4）：183-184。

[2]中國科學(xué)院微生物研究所細菌分類組。一般細菌常用鑒定方法[M]，北京：科學(xué)出版社，1978。

[3]賀路，艾曉輝，左文功.牛蛙腹水病病原研究[J]淡水漁業(yè)，1995，（03）

[4]葛艷，陳懷青，陸承平.遲緩愛德華氏菌胞外產(chǎn)物的細胞毒性和動物致病性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，（01）。

[5]李義.名特水產(chǎn)動物疾病診治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999。

[6]阮新艷，阮洪，阮敏.虎紋蛙生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)的初步研究[J]福建水產(chǎn)，1994（1）：24-28。