組織擴張與機械牽拉對皮膚組織表達硫氧還蛋白影響的初步研究

付思祺 范金財 焦 虎 劉立強 甘 承 田 佳 陳文霖 楊增杰 殷竹鳴

組織擴張與機械牽拉對皮膚組織表達硫氧還蛋白影響的初步研究

付思祺 范金財 焦 虎 劉立強 甘 承 田 佳 陳文霖 楊增杰 殷竹鳴

目的探討硫氧還蛋白（TXN）在擴張皮膚組織與正常皮膚組織中的表達差異。方法選取近兩年在我院行額部擴張器取出術(shù)的患者13例，收集患者額部擴張器張力最大點（擴張組）以及顳部行附加切口處（對照組）的全層皮膚。免疫組織化學染色、Western blot檢測TXN蛋白在擴張皮膚組織及正常皮膚組織中的表達。結(jié)果免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，擴張皮膚組織中TXN陽性細胞明顯多于正常皮膚組織（P＜0.05）；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，擴張皮膚組織中TXN表達高于正常皮膚組織。結(jié)論擴張皮膚組織中TXN蛋白表達高于正常皮膚組織，為進一步研究TXN在組織擴張中的作用提供理論基礎。

硫氧還蛋白 組織擴張 機械應力

自體組織擴張術(shù)可再生出具有完全生理功能的皮膚組織，在整形外科應用廣泛，但存在治療周期漫長、再生皮膚有限、擴張組織轉(zhuǎn)移后易壞死和感染等缺陷[1]。前期研究中，我們采集額部擴張器取出術(shù)中額部張力最大處皮膚（擴張組）和顳部行附加切口處皮膚（非擴張組），應用基因芯片技術(shù)進行全基因組掃描，尋找皮膚組織擴張相關(guān)基因，共篩選出105個存在差異表達的基因，其中90個上調(diào)基因，12個下調(diào)基因，硫氧還蛋白（Thioredoxin，TXN）就是表達上調(diào)的基因之一。近年的研究發(fā)現(xiàn)，TXN在生物體內(nèi)分布廣泛，具有抗氧化、清除自由基、促進細胞生長增殖、抑制凋亡等多種功能[2-4]，但TXN與皮膚組織擴張的關(guān)系尚未見報道。本研究采用免疫組織化學及Western Blot蛋白半定量檢測，分析TXN與組織擴張和機械應力之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2010年至2012年在我院行額部擴張術(shù)（威寧，長形，300/400 mL）的患者13例，年齡18～30歲（平均24歲），未訴及其他疾病。每周注水一次，一般擴張時間為3～4個月，養(yǎng)皮時間（最后一次注水至手術(shù)之間的間隔時間）一般為3～4周。擴張期間無感染壞死及擴張器破裂、漏液等并發(fā)癥。實驗組和對照組取材部位皮膚無損傷及病變。

實驗組標本取自擴張皮瓣的中心位置，因該部位承受應力強度最大、時間最長。對照組標本取自顳部行附加切口處正常皮膚。兩組標本大小一致，均為1.5 cm×0.5 cm，全厚皮，一分為二。一份切取后立即放入福爾馬林溶液保存，以行HE染色和免疫組化染色，另一份切取后立即放入液氮中，以行蛋白提取及Western Blot蛋白半定量實驗。本實驗通過中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 實驗儀器與試劑

倒置相差顯微鏡 （Nikon公司），組織切片機（Leice公司，RM2135），PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀 （常州中威電子儀器廠），“Tissue-Tek”TEC組織包埋機，2U2-EO型臺式干燥箱（南通科學儀器廠），組織勻漿機，分光光度計。

兔抗人TXN單克隆抗體（Epitomics公司，批號5127－1），二步法免疫組化檢測試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蛋白裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），鼠抗人TXN一抗（Abcam公司），兔抗人β-actin一抗（Santa Cruz公司），兔抗人PCNA一抗（Epitomics公司）。

1.3 TXN免疫組化染色

組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇逐步水化，抗原修復，采用二步法免疫組化染色，嚴格按說明書進行操作。TXN一抗按1∶200稀釋，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。TXN染色以細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。應用江蘇捷達科技公司圖像采集分析系統(tǒng)，在高倍鏡下，每張切片選取陽性細胞集中的10個視野采集圖像。采用陽性細胞技術(shù)法，計數(shù)10個高倍視野下陽性細胞數(shù)，求平均值。

陽性率=陽性細胞數(shù)/（陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù)）

1.4 Western blot蛋白半定量檢測

提取皮膚組織總蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，按Western Blot檢測試劑盒操作行蛋白電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，加TXN一抗（稀釋為1∶500），加入二抗（稀釋為1∶5 000），將膜浸入發(fā)光液中，再曝光，洗膠片。

1.5 統(tǒng)計學分析

因為樣本數(shù)較少（n=13），將擴張組和對照組陽性率進行配對的秩和檢驗。以SPSS13.0軟件分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE及免疫組化染色結(jié)果

HE染色發(fā)現(xiàn)，額部擴張皮膚組織層有額肌分布（圖1）；免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)擴張皮膚組織和正常皮膚組織的表皮層、真皮層細胞都有TXN表達（圖2），TXN蛋白主要表達于細胞核中，表皮細胞、皮膚成纖維細胞、毛囊細胞、汗腺細胞的細胞核都有表達（圖3）。通過比較擴張皮膚組織和正常皮膚組織陽性細胞和陰性細胞的比例，擴張皮膚組織中TXN陽性細胞比例較正常組織高（P＜0.05）。

圖1 擴張皮膚及非擴張皮膚的組織學觀察（100×）Fig.1 Histological observation of expanded skin and unexpanded skin(100×)

圖2 免疫組織化學檢測擴張皮膚及非擴張皮膚中TXN的表達Fig.2 The expression of TXN in expanded skin and unexpanded skin by immuno-histochemistry staining

圖3 擴張皮膚毛囊及汗腺中TXN的表達（400×）Fig.3 The expression of TXN in hair follicle and sweat glands of expanded skin(400×)

2.2 Western blot蛋白半定量結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，擴張組皮膚組織TXN蛋白表達水平較對照組升高（圖4）。

圖4 Western blot檢測擴張組皮膚組織與對照組皮膚組織TXN蛋白的表達Fig.4 The differential expression of TXN in expanded group and control group by Western blot

3 討論

TXN是具有氧化還原活性的小分子蛋白質(zhì)，分子量為12 KD，在生物體內(nèi)分布廣泛，具有調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、凋亡等多種生物學功能[2-4]，在皮膚抗光老化、心血管疾病、乳腺癌、肺癌等疾病的治療中均發(fā)揮重要作用。我們在前期研究中，通過基因芯片和實時定量 PCR證實，TXN基因在擴張皮膚中表達上調(diào)，但目前尚無TXN與擴張皮膚相關(guān)的研究報道。因此，我們擬在蛋白層面進一步研究TXN在擴張皮膚與正常皮膚之間是否存在表達差異。通過免疫組化及Western blot蛋白半定量檢測發(fā)現(xiàn)，擴張皮膚組織中TXN表達高于正常皮膚組織，預示著TXN在皮膚組織擴張過程中可能發(fā)揮著一定功能。

我們推測，TXN在皮膚組織擴張過程中發(fā)揮了抗氧化、清除自由基的功能。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚軟組織擴張過程中會產(chǎn)生大量自由基，其產(chǎn)生機制包括兩方面。一方面與皮膚組織在機械壓力下缺血/再灌注有關(guān)。皮膚軟組織的每次擴張，先壓力增加，毛細血管閉塞，導致急性缺血[5]。然后膠原纖維重新排列，細胞分裂增殖[6]，使擴張皮膚變軟，加之缺血、缺氧的刺激，毛細血管增生、開放，血運逐漸恢復。缺血/再灌流過程中，細胞進行無氧代謝，ATP分解為腺苷酸，最后生成氧自由基。另一方面與硅膠膜的置入有關(guān)。無論是動物還是人體，硅膠囊周圍會逐漸形成纖維囊。關(guān)于其形成機理尚不完全清楚，許多學者認為，硅膠假體盡管化學性質(zhì)極其穩(wěn)定、組織相容性好，但仍有硅膠微粒逸出進入假體周圍組織，尤其是直徑為10～60 μm的硅膠微粒，作為一種抗原或半抗原誘發(fā)免疫反應，趨化吸引白細胞，白細胞膜上的還原型輔酶Ⅱ可將還原型輔酶Ⅱ的電子傳遞給氧，產(chǎn)生氧自由基[7-8]。氧自由基產(chǎn)生后，可趨化吸引白細胞浸潤，構(gòu)成惡性循環(huán)。這是纖維囊內(nèi)氧自由基的主要來源。此外，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[9]，皮膚組織經(jīng)過擴張后，氧自由基使生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起長鏈反應，使其終末代謝產(chǎn)物丙二醛（Malodialdehyde，MDA）含量增高，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性下降。說明硅膠纖維囊形成過程中產(chǎn)生了氧自由基。

硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白（TXN）、硫氧還蛋白還原酶（TXNR）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），是一個廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要的作用。因此，TXN最重要的作用就是抗氧化，能起到自由基清除劑的作用[2-4]。TXN作為一種供氫體而有著多種生物活性，自由基清除劑是其生物學活性之一。氧自由基清除劑能夠減輕組織、器官缺血造成的再灌注損傷。TXN其活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）的兩個Cys從二巰基到二硫鍵的可逆性反應與體內(nèi)的氧化還原反應密切相關(guān)。

其次，TXN在皮膚組織擴張過程中可能參與了細胞增殖過程。因為TXN不但能清除自由基，而且具有抑制凋亡和促進細胞生長的多重生物學作用，可促進組織損傷后的修復與再生[2-4]。TXN也是一種具有獨特作用機制的生長因子。TXN產(chǎn)生的氧化還原反應能控制一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)其與DNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。細胞內(nèi)的TXN可以作為細胞的分泌因子，發(fā)揮細胞因子樣或趨化因子樣的活性。細胞在應激狀態(tài)下可以將TXN分泌到胞外[10]，作為自分泌和旁分沁因子保護細胞[11]，抵抗凋亡[10]，抗炎癥[12]和促進生長[13]。Wakasugi等[13]發(fā)現(xiàn)，TXN可作為自分泌的生長因子，并與白細胞介素1和2協(xié)同作用，發(fā)揮促進細胞增殖生長的功能。

免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，TXN廣泛分布在哺乳動物的不同組織中[14]。目前，TXN分為TXN-1和TXN-2兩類。TXN-2僅位于線粒體中[15-17]，TXN-1主要位于細胞漿[18]。目前尚未發(fā)現(xiàn)TXN-1帶有向核定位的信號序列，但仍可在腫瘤細胞的細胞核中發(fā)現(xiàn)[19-20]，并且細胞在經(jīng)過H2O2[21]、PMA[22]和紫外線[23]的處理后，均會導致TXN-1從胞質(zhì)向胞核的遷移。TXN-1中的一個基本的區(qū)域，Lys-81、82和85可能與一個核內(nèi)定位的必需組成因子相互作用，從而使TXN-1得以進入核內(nèi)[23]?；蛘撸琓XN-1的核定位由TXN相互影響蛋白（TXNIP）介導，這種蛋白同時和TXN-1和定位因子α1相互作用[20-21]。TXN-1在核內(nèi)調(diào)控各種氧化還原反應敏感的轉(zhuǎn)錄因子的活性，比如細胞核因子-κB（NF-κB），激活物蛋白1（AP-1），氧化還原反應因子1（Ref-1）和 p53[11，24]，但是這種調(diào)節(jié)可能與細胞類型相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，擴張皮膚組織和正常皮膚組織中TXN-1主要位于細胞核中，其細胞定位與促進細胞增殖的具體關(guān)系并不清楚，還需要進一步研究。

我們曾通過基因芯片和實時定量PCR證實TXN mRNA在擴張皮膚組織中較正常組織增高。本實驗通過免疫組織化學和Western Blot發(fā)現(xiàn)，TXN主要位于皮膚組織的細胞核中，TXN蛋白表達在擴張皮膚組織中較正常組織高，為進一步研究TXN蛋白與皮膚組織擴張機制的關(guān)系，提供了新的思路和線索。

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The Differential Expression of TXN between Expanded Skin Tissue and Normal Skin Tissue in Vivo

FU Siqi,FAN Jincai,JIAO Hu,LIU Liqiang,GAN Cheng,TIAN Jia,CHEN Wenlin,YANG Zengjie,YIN Zhuming.

Ninth Department of Plastic Surgery,Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding author:FAN Jincai(E-mail:fanjincaimd@hotmail.com).

ObjectiveTo investigate the difference of TXN protein expression between the expanded skin and the normal skin.MethodsFrom 2010 to 2012,13 patients underwent forehead expanded flap transfer were included in this study. Full-thickness skin were harvested from central forehead skin with maximum strain(expanded group)and temporal additional excision sites (control group).Immunohistochemistry and western blot were used to detect the TXN expression between the expanded skin and the normal skin.ResultsThe positive cell number of TXN in the expanded skin tissue was more than that in normal skin tissue showed by immunohistochemistry staining.Western bolt showed that the TXN expression in the expanded skin tissue is higher than in normal skin tissue.ConclusionThe TXN protein expression in expanded skin tissue is higher compared with normal skin tissue.It provides the theoretical basis for the further research of TXN function on skin tissue expansion.

Thioredoxin(TXN);Tissue expansion;Mechanical stress

R622

A

1673－0364（2013）01－0014－04

2012年11月25日；

2013年1月6日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.004

100144 北京市 中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院整形九科。

范金財（E-mail：fanjincaimd@hotmail.com）。