水貂干擾素-β基因的克隆與序列分析

楊培培 衣服德 馮永勝 張 倩 （山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100）

干擾素(interferon，IFN)是一類高活性多功能的糖蛋白，根據(jù)對(duì)其基因核酸序列分析結(jié)果表明，它于5～10億年前即于生物學(xué)細(xì)胞中存在，是生物體內(nèi)一類古老的保護(hù)因子[1]。IFN具有很高的生物學(xué)活性，其比活性為108個(gè)IU/mg蛋白質(zhì)，抗病毒作用無(wú)特異性，是廣譜抗病毒物質(zhì)。目前，IFN在臨床中的使用愈來(lái)愈普遍，治療效果也比抗病毒藥物要好[2]。

山東省是水貂養(yǎng)殖大省，近年來(lái)，隨著水貂養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，毛皮動(dòng)物主要傳染病流行嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率居高不下，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是水貂犬瘟熱、水貂細(xì)小病毒性腸炎、水貂阿留申病等嚴(yán)重威脅水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

動(dòng)物體內(nèi)自身產(chǎn)生的干擾素極其微量，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是獲得干擾素的一條有效途徑。本試驗(yàn)從水貂肝臟組織中提取基因組DNA，擴(kuò)增出水貂IFN-β基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，為重組水貂IFN-β類生物制劑的研制和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為更好的控制水貂病毒性疫病提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮水貂肝臟組織采自于山東諸城某養(yǎng)貂場(chǎng)。pMD18-T為TaKaRa產(chǎn)品，大腸埃希菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，引物合成和全自動(dòng)測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成。PCR儀、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq酶、DNA凝膠回收試劑盒、6×DNA上樣緩沖液、Marker E、goldview核酸染料為賽百盛產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水貂肝臟組織基因組的提取 切取水貂肝臟組織5g左右，剔除結(jié)締組織，吸水紙吸干血液，剪碎放入研缽(越細(xì)越好)，加入液氮，磨成粉末，加5ml生理鹽水充分混勻，3000rpm離心5min，將上清400μl收毒入Eppendorf管，加入8μl蛋白酶K(20mg/ml)和92μl細(xì)胞消化裂解液，52℃作用8h后，每管加入500μl酚/氯仿進(jìn)行抽提，12000rpm離心15min，然后將上清轉(zhuǎn)移到一新的Eppendorf管中(若蛋白量大則再用酚氯仿抽提一次)。再加入上清2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇400μl洗滌沉淀，待酒精揮發(fā)干燥后加適量TE溶解，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水貂IFN-β基因引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)Genbank已發(fā)表的水貂IFN-β基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增IFN-β基因，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為561bp。引物由大連寶生物工程有限公司合成，用ddH2O水稀釋到20pmol/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 水貂IFN-β基因的PCR擴(kuò)增 以提取的水貂肝臟組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25ml，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；94℃1min，51～62℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行摸索。取5μlPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。鑒定正確后將剩余樣品全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.4 水貂IFN-β基因的克隆與鑒定 將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，以 PCR鑒定和EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.5 IFN-β全基因的序列測(cè)定及分析 將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測(cè)序，利用DNAstar6.0 MegAlign軟件，將所測(cè)定的IFN-β基因的核苷酸序列與GenBank已收錄的序列進(jìn)行比對(duì)分析。將測(cè)序確定為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pMD18-IFN-β。

2 結(jié)果

2.1 目的基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

設(shè)定梯度溫度51～62℃退火，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到在51℃時(shí)出現(xiàn)特異性條帶，長(zhǎng)度約為561bp，與預(yù)期結(jié)果相符，所以51℃為退火溫度。如圖1所示：

圖1 梯度PCR電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定

2.2.1 PCR鑒定結(jié)果 將含有IFN-β基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，在561bp處出現(xiàn)特異性條帶，如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2.2 酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SalⅠ雙酶切后得到約1000bp和約2250bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，由此證明了目的基因已插入到pMD18-T載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 IFN-β測(cè)序結(jié)果

取含陽(yáng)性重組質(zhì)粒的菌落，培養(yǎng)后的菌液由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用DNASTAR軟件將該基因序列與Genbank上的水貂IFN-β基因的DNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果所克隆到的水貂IFN-β基因全長(zhǎng)56lbp，編碼186個(gè)氨基酸，核甘酸序列同源性為100%。

2.4 同源性比較

試驗(yàn)擴(kuò)增出的基因片段全長(zhǎng)為561bp，共編碼186個(gè)氨基酸。本試驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)增出的水貂IFN-β與GneBnak上已公布的人類的INF-β基因相比較，核苷酸序列同源性為34.06%，與鼠的同源性為37.60%，與犬的同源性為99.15%，與鼬的同源性為99.64%。將擴(kuò)增的IFN-β基因序列與從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的其他種屬INF-β基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 IFN-β基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

3 討論

上世紀(jì)30年代，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體感染某一病毒后，會(huì)對(duì)另一種抗原性毫無(wú)關(guān)系的病毒發(fā)生干擾現(xiàn)象。直到1957年，Isaacs和Lindenmann利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)才了解到病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子，作用于其它細(xì)胞，干擾感染病毒的復(fù)制，因而命名為干擾素(interferon，IFN)[3]。由于干擾素具有調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和病毒感染的抵抗力等重要作用，所以對(duì)其研究一直是細(xì)胞因子研究方面的重點(diǎn)之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表達(dá)chIFN-α基因并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[4]，1995年Digby等又成功地克隆了雞IFN-γ基因[5]。干擾素是第一個(gè)在分子水平上進(jìn)行研究的細(xì)胞因子，其經(jīng)驗(yàn)很快用于其他細(xì)胞因子的研究，并獲得了巨大的進(jìn)展，促進(jìn)了新藥開(kāi)發(fā)和分子生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展。

目前關(guān)于水貂INF-β的研究報(bào)道比較少，對(duì)β干擾素克隆及表達(dá)方面的研究，還沒(méi)有相關(guān)文章報(bào)道。通過(guò)本研究，對(duì)水貂一些疾病如水貂犬瘟熱、水貂細(xì)小病毒性腸炎、水貂阿留申病的預(yù)防有指導(dǎo)性意義。另外，少量干擾素即可延遲和減少病毒的增殖，大量干擾素則可阻止病毒的復(fù)制。動(dòng)物體內(nèi)自身產(chǎn)生的干擾素極其微量，以傳統(tǒng)的方法難以制備和純化，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是解決這一難題的有效途徑。在我國(guó)干擾素研究起步較晚，而我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，干擾素對(duì)控制水貂病毒性疫病又具有很好的預(yù)防作用，因此對(duì)水貂干擾素的研究具有重要意義。

有關(guān)研究表明，干擾素的保護(hù)作用具有相對(duì)的種屬特異性，如家禽產(chǎn)生的干擾素只能保護(hù)家禽，不能保護(hù)其它動(dòng)物。本試驗(yàn)所克隆的IFN-β基因序列與Genbank上公布的水貂IFN-β基因序列同源性為100%，與GneBnak上已公布的人類的INF-β基因序列同源性為34.06%，與鼠的同源性為37.60%，與犬的同源性為99.15%，與鼬的同源性為99.64%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，不同種屬動(dòng)物產(chǎn)生的干擾素在基因水平上存在一定差異，這與上述研究結(jié)果一致。本研究首次從水貂肝臟組織中克隆得到干擾素β基因，所克隆的基因在同屬動(dòng)物中高度保守，為進(jìn)一步原核表達(dá)和研制重組干擾素制劑提供前提條件。

[1] 郭小權(quán), 諶南輝. 干擾素的研究進(jìn)展[J]. 廣西畜牧獸醫(yī), 2000, 16(6): 37-39.

[2] 喬立東, 王金秋. 干擾素在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)牧業(yè)通訊, 2009(7): 9-11.

[3] 侯云德, 吳淑華. 干擾素[M]. 北京: 北京人民衛(wèi)生出版社, 1981.

[4] Sekellick M J, Ferrandion A F, Hopkins D A,etal. Chicken interferon gene: Cloning, expression and analysis[J]. J Interferon Res, 1994, 14: 71.

[5] Digby M R,Lowenthal J W. Cloning and expression of the chicken interferon-γ gene[J]. J Interferon Res,1995,15:939-945.