非對(duì)稱性二甲基精氨酸在慢性心力衰竭發(fā)病過程中的作用機(jī)制研究*

黃俊喜，鄒文姝，曾火才，曾 燕，曾林源

(廣東省河源市和平康平醫(yī)院急診科，廣東 河源 517200)

80%心血管疾病的終末階段都會(huì)出現(xiàn)慢性心力衰竭癥狀［1］，主要表現(xiàn)為肺循環(huán)和體循環(huán)出現(xiàn)淤血特征。對(duì)慢性心力衰竭病癥的診斷難度較大，主要是針對(duì)輕、中度慢性心力衰竭患者的初期診斷及治療策略設(shè)定能夠顯著改善患者的預(yù)后。慢性心力衰竭(CHF)發(fā)病與神經(jīng)激素異常激活、炎性細(xì)胞因子如TNF－α等有緊密的關(guān)系［2］。盡管如此，近來研究發(fā)現(xiàn)，在慢性心力衰竭(CHF)患者血清中非對(duì)稱性二甲基精氨酸能夠抑制一氧化氮合酶的生成［3］，進(jìn)而影響一氧化氮(NO)的生成，而且從基因水平也得到了一致性結(jié)果，這一機(jī)制可能是慢性心力衰竭發(fā)病的一個(gè)產(chǎn)生原因，本研究探討血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸濃度在慢性心力衰竭患者發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:隨機(jī)選擇2008年2月至2010年12月在我院住院慢性心力衰竭患者70例，男37例，女33例，年齡55－65歲，平均(60.23±2.13)歲，于入院當(dāng)天進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，并記錄左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)按紐約心臟學(xué)會(huì)(NYHA)標(biāo)準(zhǔn)心功能分級(jí)為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)，其中Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)25例，Ⅳ級(jí)23例。所有研究對(duì)象均排除急慢性感染、肝腎功能不全、嚴(yán)重的電解質(zhì)紊亂、自身免疫性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、應(yīng)用類固醇治療者和半年內(nèi)有過急性心肌梗死者。另外，選擇同時(shí)期經(jīng)過體檢健康者70例，男36例，女34例，年齡55－65歲，平均(60.45±2.37)歲。兩組比較差異具有可比性，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方 法

1.2.1 檢測(cè)指標(biāo)及方法:兩組受試者入院后空腹10－13h，在仰臥姿勢(shì)條件，靜息狀態(tài)下抽取2mL肘靜脈血［9］，采用抗凝管裝存，血漿分離后－70℃保存，采用ELISA法在酶標(biāo)儀上測(cè)定血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸的含量。采用硝酸還原酶比色法(南京建成生物工程研究所檢測(cè)血清中NO的含量。采用彩色多普勒超聲診斷儀(美國ACUSIONl28 XWIO型)變頻探頭2.0－3.5MHz。左心室參數(shù)測(cè)定包括舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.2.2 RNA 提取:1000rpm/min離心細(xì)胞收取，轉(zhuǎn)至1.7mL離心管，加入 1mL Trizol溶液，加入 0.2mL氯仿。Vortex混勻，5min室溫靜置，然后11000rmp離心，時(shí)間為15min。將上層的水相轉(zhuǎn)入到1.5mL EP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后置于－20℃冰箱中，過30min后，11000rmp離心10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000rmp離心6min。棄上清，靜置5min。

1.2.3 RT－PCR:NanoDrop定量后按照 TOYOBO 的RT－PCR試劑盒說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃25min(RT－PCR反應(yīng))85℃ 5sec(酶失活反應(yīng))。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量Q－PCR:用 Primer Premier 5.0的軟件設(shè)計(jì)、并合成了相關(guān)基因引物，上海博尚生物技術(shù)有限公司合成引物，其特異性利用融解曲線進(jìn)行分析驗(yàn)證。cDNA表達(dá)豐度采用Ct值進(jìn)行檢測(cè)，β－actin的Ct值作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束之后，利用SYBR Green(Toyobo)按說明書進(jìn)行熒光定量PCR。三步法進(jìn)行Q－PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:

95℃10sec 1 cycle

95℃15sec

60℃20sec 45 Cycles

72℃35sec

Dissociation stage

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)采用方差分析。

2 結(jié)果

表1 各組血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸水平(pg/mL)及左心室超聲心動(dòng)圖各參數(shù)比較

2.1 不同組間血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸水平及左 心室參數(shù)比較:不同心功能級(jí)別的慢性心力衰竭患者相比于對(duì)照組血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，ADMA隨著心功能級(jí)別的升高，含量也隨之增加。LVEDD沒有規(guī)律性變化趨勢(shì)，但是LVEF在患病組要低于對(duì)照組，同時(shí)與心功能級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，見表1。

2.2 不同組間血清NO及NOS的含量比較:不同心功能級(jí)別的慢性心力衰竭患者相比于對(duì)照組血清NO及NOS水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，NO及NOS在對(duì)照組中的含量高于患病組，而且在患病組中與心功能級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。

表2 各組血清NO(pg/mL)及NOS的含量比較

2.3 不同心功能級(jí)別DDAH及NOS基因的表達(dá)水平:DDAH能夠分解代謝機(jī)體內(nèi)五分之四的非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)，使其排出體外，而NOS負(fù)責(zé)催化L－精氨酸生成NO。這兩個(gè)基因在慢性心力衰竭發(fā)病中或許起到了關(guān)鍵性的作用。我們通過熒光定量PCR檢測(cè)了DDAH－1，DDAH－2，NOS基因在對(duì)照組及患病組中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDAH－2在不同組間無明顯變化，但是DDAH－1及NOS的基因表達(dá)水平的患病組高于低于對(duì)照組，同時(shí)其表達(dá)水平與心功能級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。(如圖1)。

圖1 不同心功能級(jí)別DDAH及NOS基因的表達(dá)水平

3 討論

Vallance和他的研究團(tuán)隊(duì)在1992年報(bào)道ADMA是一氧化氮合酶的天然抑制劑［4］。ADMA能夠抑制NO的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂及心血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化，慢性心力衰竭等疾病在研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注也逐漸揭開了血清ADMA這一心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的面紗。

從病理角度分析，慢性心力衰竭患者血清中ADMA水平逐漸升高。首先，ADMA能夠通過抑制NO產(chǎn)生進(jìn)行加劇慢性心力衰竭癥患病，具體來說，NO的含量下降能夠?qū)е聝?nèi)皮功能紊亂［5］，而內(nèi)皮功能紊亂與慢性心力衰竭緊密相關(guān)，這一紊亂狀態(tài)無法被機(jī)體保護(hù)性分子如神經(jīng)激素類因子所改善。其次，ADMA的初期體內(nèi)累積能夠抑制二甲基精氨酸的活性［6］，二甲基精氨酸是ADMA的主要降解途徑。而二甲基精氨酸的活性受抑制機(jī)理是由于高度的氧化造成的，而且慢性心力衰竭的癥狀加劇也與過度氧化離不開［7］。

近來研究顯示，血液中高濃度的ADMA被發(fā)現(xiàn)與慢性心力衰竭病癥有緊密聯(lián)系。這一發(fā)現(xiàn)也提示我們是否ADMA能夠作為慢性心力衰竭的診斷指標(biāo)。也有研究顯示，ADMA伴隨慢性心力衰竭的高濃度特征可能是由于代償性機(jī)能減退的原因。為了解決這一難題，我們?cè)噲D從分子水平進(jìn)行研究，選擇了DDAH基因，DDAH負(fù)責(zé)分解代謝機(jī)體內(nèi)五分之四的ADMA［8］，解除其對(duì)一氧化氮合酶的抑制作用，DDAH有兩個(gè)亞型，DDAH－1和DDAH－2，經(jīng)過熒光定量PCR檢測(cè)健康對(duì)照組和患病組中的DDAH基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示，盡管DDAH－2基因表達(dá)水平基本沒有變化，但DDAH－2有顯著的下調(diào)趨勢(shì)。同時(shí)NOS也與其趨勢(shì)相一致。

［1］ 胡春松，魏云峰.心力衰竭患者血清CA125，CA199水平變化及意義［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2005，5(1):415－517.

［2］ 李澤堅(jiān).實(shí)用臨床胸外科學(xué)［M］.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007.424－425.

［3］ 石丹，董少紅，高虹，等.充血性心力衰竭患者CA125與EF的關(guān)系［J］.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2002，23(2):97－99.

［4］ 陳倩，李小鷹，李江源.老年男性心力衰竭患者性激素水平調(diào)查及與同齡健康男性的比較［J］.中華心血管病雜志，2005，33:505－508.

［5］ Adams K，Sueta C，Mihar G.Gender differences in survival in advanced heart failure:insights from the first study［J］.Circulation，1999，99:1816－1821.

［6］ Koenig HG.Depression in hospitalized older patients with congestive heart failure［J］.Gen Hosp Psychiatry，1998，20:29－ 43.

［7］ Guck T，Elsasser G，KAvan M，et al.Depression and conges-tion heart failure［J］.Congestive Heart Fail，2003，9:163－169.

［8］ Tsay SL，Chao YF.Effects of perceived self－efficacy and functional status on depression with chronic heart failure［J］.Nurs Res，2002，10(4):271－278.