耐高溫植酸酶的熱穩(wěn)定性評(píng)估方法分析

■王海燕 湯海鷗 王曉睿 楊祿良 劉 影

（1.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京 100081；2.生物飼料開發(fā)國(guó)家工程研究中心，北京 100081）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)水平的提高，植酸酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。植酸酶即肌醇六磷酸磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級(jí)肌醇磷酸衍生物和無機(jī)磷酸，可有效提高植物性飼料中磷的利用率，增加可利用養(yǎng)分的數(shù)量，可以定量地替代無機(jī)磷飼料。由于植酸酶催化效率高，很小的添加量就能替代幾十倍至百倍以上的磷酸氫鈣或骨粉，為飼料配方設(shè)計(jì)節(jié)省出了寶貴的空間，降低飼料成本，提高飼料消化率，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，減輕畜禽排放磷對(duì)環(huán)境的污染，其添加效果日益得到各方面的認(rèn)可。

植酸酶應(yīng)用大多以干粉粒的形式在飼料加工調(diào)質(zhì)和制粒之前添加，而酶在制粒的過程中所處的環(huán)境是高溫蒸汽，活力損失較大。目前，制備耐高溫植酸酶的主要方法有：①篩選能夠產(chǎn)耐高溫植酸酶的微生物基因(自然基因或者改造基因)及其相應(yīng)的生產(chǎn)菌種；②采用包被、微囊化等劑型技術(shù)提高耐溫性[1-2]。前者是酶蛋白分子本身具有較高的熱穩(wěn)定性，故效果最佳，而后者因?yàn)槌杀?、包材影響釋放等原因在?shí)際使用中存在一些弊端。這兩種類型的耐高溫植酸酶都在市場(chǎng)上有售，因?yàn)闆]有統(tǒng)一的、公認(rèn)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，各家產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性也是眾說紛紜。本文綜合目前評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性的方法[3-5]及我們的實(shí)際檢測(cè)情況作一介紹，以便為植酸酶的熱穩(wěn)定性評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)室評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性的方法

1.1 水浴法

按照國(guó)標(biāo)法操作，將固體植酸酶溶解釋放到緩沖液中，取一定體積一定稀釋濃度的溶液到玻璃試管中，將玻璃試管放到已經(jīng)達(dá)到目的溫度的水浴鍋中保溫一定時(shí)間后測(cè)定酶活力[5]。該方法是通過調(diào)節(jié)水浴鍋中水溫和水浴時(shí)間來反映溫度對(duì)植酸酶活性的影響，方法簡(jiǎn)單、操作方便。在水浴處理過程中，酶蛋白分子是完全暴露在高溫的水環(huán)境中，與實(shí)際制粒條件差別很大，當(dāng)體系中含有大量的自由水時(shí)，就會(huì)破壞酶分子內(nèi)部的氫鍵，而氫鍵在維持酶的空間構(gòu)象中起著重要的作用，因此酶分子構(gòu)象容易發(fā)生變化，酶就易于變性失活。

水浴法評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性時(shí)要注意兩個(gè)問題：一是水浴法適合于評(píng)估酶蛋白分子本身具有熱穩(wěn)定性的植酸酶產(chǎn)品，不適合于評(píng)估包被型植酸酶的耐熱性。水浴法將植酸酶溶解釋放出來實(shí)際上就是去除了包被材料的保護(hù)作用，無法反映出后處理工藝對(duì)熱穩(wěn)定性的影響。二是熱處理時(shí)酶液濃度對(duì)保存率有影響。在固體酶的溶解釋放過程中，釋放出的不僅有酶蛋白分子，還有其他離子，稀釋倍數(shù)不同則這些離子的濃度也不同，因而離子強(qiáng)度不同。蛋白質(zhì)所處環(huán)境中的離子強(qiáng)度能夠影響其空間結(jié)構(gòu)，功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。為了驗(yàn)證此觀點(diǎn)，進(jìn)行了以下試驗(yàn)論證。

取0.208 6 g植酸酶樣品，溶于約80 ml緩沖液中，25 ℃、250 r/min震蕩30 min，定容至 100 ml，取一定體積的溶液于4 000 r/min離心10 min，取上清得原酶液，分別測(cè)定原酶液、原酶液80℃保溫3 min、原酶液稀釋至 1/50再80℃保溫3 min的酶活力，結(jié)果見表1。

表1 不同熱處理濃度對(duì)酶活保存率的影響

從上面試驗(yàn)結(jié)果可以看出，同一個(gè)樣品，熱處理時(shí)不同的酶溶液濃度可導(dǎo)致不同的保存率。因此面對(duì)不同來源的數(shù)據(jù)，比較不同產(chǎn)品的保存率時(shí)一定要慎重。

在實(shí)際采用植酸酶國(guó)標(biāo)GB/T 18634—2009進(jìn)行測(cè)定過程中，我們一般認(rèn)為實(shí)測(cè)吸光值A(chǔ)-A0在0.2～0.5范圍內(nèi)數(shù)據(jù)為可采用數(shù)據(jù)。若超出此范圍，則需相應(yīng)地調(diào)整稀釋倍數(shù)，重新測(cè)定，即調(diào)整試樣溶液的濃度在0.4 U/ml左右。因此在進(jìn)行熱評(píng)估過程中，我們統(tǒng)一熱處理的濃度為測(cè)定濃度的10倍，即試樣溶液的濃度在4 U/ml左右，對(duì)多數(shù)植酸酶產(chǎn)品而言，如果保存率不低于10%即可適當(dāng)?shù)南♂屵M(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2 干熱法

干熱法是將植酸酶樣品在恒溫干燥箱里直接處理一定時(shí)間，然后測(cè)定植酸酶保存的活性[6]。通常酶在非常干燥的情況下，構(gòu)象比較穩(wěn)定，具有一定的耐熱性。因干熱法的條件與實(shí)際制粒條件差異太大，又不像水浴法那樣將酶蛋白分子置于苛刻的條件下反映出酶本身的熱穩(wěn)定性，用干熱法得到的酶的保存率都偏高，參考意義較小，因此實(shí)際中應(yīng)用得相對(duì)較少。

1.3 濕熱法

濕熱法即模擬制粒法，是干熱法基礎(chǔ)上進(jìn)一步考慮調(diào)質(zhì)和制粒時(shí)濕度因素，使得在方法學(xué)上實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)調(diào)質(zhì)和制粒加工對(duì)植酸酶活性的影響更接近實(shí)際調(diào)質(zhì)和制粒條件[6]。顆粒飼料制粒過程中酶制劑經(jīng)歷的是高溫、高濕和高壓的環(huán)境，濕熱法模擬的是高溫、高濕的條件。

本實(shí)驗(yàn)室的具體操作是：①測(cè)玉米面實(shí)際含水率；②取一定量植酸酶與玉米面混合均勻，調(diào)水分到16%。植酸酶因比例小水分可忽略；③將上述混合物放入已達(dá)目的溫度的干燥箱中，保溫一定時(shí)間后取出自然冷卻至室溫；④測(cè)酶活力。在實(shí)際操作過程中，步驟②因手工操作很難混合均勻，取樣檢測(cè)濕熱處理前的酶活時(shí)變異系數(shù)很大。雖然可以根據(jù)植酸酶與玉米面的混合比例計(jì)算出混合物中植酸酶的理論酶活，但我們的經(jīng)驗(yàn)是理論值和實(shí)測(cè)值是有差異的。為了解決混合不均勻?qū)υ囼?yàn)結(jié)果的影響，我們采取的措施是步驟②精確平行稱量?jī)煞葜菜崦笜悠贩謩e與玉米面混合，一份全部混合物用于測(cè)定濕熱處理前的酶活力，另一份熱處理后全部抽提測(cè)定酶活力。通過這一具體操作上的調(diào)整，較好地解決了因混合不均勻?qū)е碌慕Y(jié)果變異大的問題。

實(shí)踐證明，經(jīng)干熱法和濕熱法評(píng)估得到的耐高溫植酸酶的保存率均比水浴法和實(shí)際制粒法的高，本實(shí)驗(yàn)室中通常采用水浴法快速評(píng)估植酸酶的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)75℃、5 min或80℃、5 min熱處理后，不同廠家的耐高溫植酸酶保存率差別比較大，建議有評(píng)估條件的用戶首先用水浴法對(duì)裸酶耐高溫的植酸酶產(chǎn)品（即非包被的耐高溫植酸酶）進(jìn)行初步篩選評(píng)估。

2 實(shí)際制粒條件下評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性

無論水浴法、干熱法還是濕熱法來評(píng)估耐高溫植酸酶的熱穩(wěn)定性都只能作為參考，植酸酶能否耐受制粒的條件、制粒后酶活保存率能達(dá)到多少，最具有說服力的就是實(shí)際制粒后測(cè)定的結(jié)果。實(shí)際制粒評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性存在兩個(gè)問題：一是植酸酶在配合飼料中的含量太低，誤差對(duì)結(jié)果影響大；二是植酸酶因添加量小混合均勻度的問題難以解決。

植酸酶實(shí)際使用中的理論含量一般是400～500 U/kg配合飼料，而植酸酶國(guó)標(biāo)法的檢出下限是130 U/kg。酶活太低則測(cè)定時(shí)吸光值很低，落在了國(guó)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度與吸光值成線性關(guān)系的范圍外，檢測(cè)值無法準(zhǔn)確地反映實(shí)際值。為解決這個(gè)問題，我們將國(guó)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度稀釋10倍做適用于配合飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將取樣量加大到5 g定容到100 ml緩沖液中。即使這樣，結(jié)果依然不理想，試驗(yàn)誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響所占比例大?，F(xiàn)在市場(chǎng)上的耐高溫植酸酶常見劑型為顆粒型，添加量小，即使采用逐級(jí)稀釋也很難避免混合不均勻的問題，即使混合均勻了，因測(cè)量取樣量少而加大了數(shù)據(jù)變異。下面以本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的一組樣品的原始數(shù)據(jù)來說明這個(gè)問題，見表2。

表2 加酶飼料的檢測(cè)原始數(shù)據(jù)

樣品A3T檢測(cè)了4次，得出的4個(gè)酶活力差別很大。類似的情況多次出現(xiàn)在正常添加劑量的加酶飼料樣品中。國(guó)標(biāo)法中對(duì)重復(fù)性的描述是：同一試樣兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)偏差，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于15%。相對(duì)偏差=（個(gè)別測(cè)定值-算數(shù)平均值）/算數(shù)平均值，表2的連續(xù)2 d的2次平行測(cè)定，相對(duì)偏差分別達(dá)到了47.46%和100%。用這樣的數(shù)據(jù)來評(píng)判制粒效果結(jié)果是不可信的。

為了解決加酶飼料酶活力測(cè)定誤差影響大和混合不均勻的問題，我們?cè)O(shè)計(jì)的制粒實(shí)驗(yàn)方案是加大植酸酶的用量，一般是正常用量的10～20倍，各取調(diào)質(zhì)后制粒前粉狀飼料和制粒后顆粒飼料樣品5個(gè)平行樣，按照國(guó)標(biāo)法檢測(cè)植酸酶活力，如果相對(duì)偏差不大于15%，說明檢測(cè)數(shù)據(jù)是可以采用的，結(jié)果分別取平均數(shù)。對(duì)于相對(duì)偏差大于15%的數(shù)據(jù)進(jìn)行舍棄后再取平均數(shù)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案能在一定程度上提高試驗(yàn)結(jié)果的可信性，但是也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)差別大的情況。下面我們用實(shí)際檢測(cè)情況為例說明這個(gè)問題。本次制粒實(shí)驗(yàn)植酸酶檢測(cè)酶活為9 015 U/g，添加量是1.2 kg/500 kg飼料，則制粒前加酶飼料酶活力理論值是21.636 U/g，制粒前和制粒后檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 制粒實(shí)驗(yàn)加酶飼料檢測(cè)結(jié)果

制粒前加酶飼料的5個(gè)測(cè)定值的相對(duì)偏差均小于15%，酶活力平均值為18.112 U/g，根據(jù)植酸酶樣品酶活力和添加量換算出來的酶活力理論值是21.636 U/g，說明飼料中的一些成分對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。制粒后5個(gè)測(cè)定值的平均數(shù)是13.08 U/g，制粒保存率為72.22%，制粒后樣品1酶活力10.46 U/g和制粒后樣品5酶活力15.09 U/g相對(duì)偏差分別是20%和15.4%，舍棄后平均值為13.28 U/g，制粒保存率為73.33%。制粒后樣品5相對(duì)偏差15.4%，剛超出國(guó)標(biāo)規(guī)定，如果數(shù)據(jù)采用，則制粒后酶活力平均值為13.74 U/g，制粒保存率為75.86%。因?yàn)閿?shù)據(jù)的采用情況不同，制粒后酶活保存率可以為72.22%、73.33%或者75.86%，但是總體來說，保存率差別不是很大。本次制粒實(shí)驗(yàn)較好地反映出了制粒后酶活力的保存情況。

在上述制粒實(shí)驗(yàn)中，還有一個(gè)現(xiàn)象值得注意，飼料調(diào)制和制粒前的粉狀飼料檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差均小于15%，說明植酸酶混合的均勻度比較好，然而制粒后檢測(cè)有兩個(gè)結(jié)果偏差大于15%，推測(cè)這種變化不僅僅是由混合均勻度導(dǎo)致，可能與制粒過程中調(diào)制機(jī)內(nèi)部溫濕度及壓力不均勻有關(guān)。

影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，如果考慮不全面很可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。目前耐高溫植酸酶用戶最關(guān)心的問題是植酸酶制粒后能保存多少酶活，能否滿足動(dòng)物生產(chǎn)中的需要。不同飼料廠由于設(shè)備、飼料配方、加工工藝等的差異，飼料制粒過程中的調(diào)質(zhì)溫度、調(diào)制時(shí)間、蒸汽壓力、環(huán)模孔徑等參數(shù)有較大的差異。對(duì)于某一種植酸酶的耐熱性評(píng)價(jià)，需要針對(duì)不同的飼料調(diào)質(zhì)、制粒參數(shù)，在濕熱蒸汽處理時(shí)間上要做出適當(dāng)調(diào)整，使評(píng)估方法更接近于特定飼料廠生產(chǎn)的實(shí)際。但是評(píng)估也并非取樣測(cè)定一下這么簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否合理，取樣是否合理，取樣的數(shù)量是否足夠具有代表性等等，很多因素會(huì)影響到結(jié)果是否能真實(shí)地反映出植酸酶的制粒效果。

有研究表明，植酸酶能夠提高蛋白質(zhì)、氨基酸、能量、礦物質(zhì)的利用率[7]，高劑量植酸酶顯著提高肉雞的生長(zhǎng)性能以及表觀代謝能(AME)、蛋白質(zhì)、氨基酸、鈣、磷的消化率。有研究表明，高劑量添加植酸酶（8 000 FTU/kg）不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成不良影響[8]。因此，考慮到正常添加量在實(shí)際檢測(cè)中誤差影響太大，建議客戶在通過實(shí)際制粒評(píng)估植酸酶熱穩(wěn)定性時(shí)，加大植酸酶的劑量，一方面可以提高評(píng)估實(shí)驗(yàn)本身的科學(xué)性和可信度；另一方面，用于評(píng)估的飼料可以正常的使用，不會(huì)造成浪費(fèi)或不良后果。

3 小結(jié)

通過實(shí)驗(yàn)，我們建議耐高溫植酸酶熱穩(wěn)定性評(píng)估的方法為：

①實(shí)驗(yàn)室評(píng)估。水浴法，將酶溶液濃度調(diào)整到4 U/ml左右，在一定溫度的水浴中保溫一定時(shí)間后測(cè)酶活力。保存率（%）=熱處理后的酶活/原酶活×100。②制粒評(píng)估。制粒時(shí)植酸酶添加到正常用量的10～20倍，各取調(diào)質(zhì)后制粒前粉狀飼料和制粒后顆粒飼料樣品5個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定。將國(guó)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度稀釋10倍做適用于加酶飼料的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照國(guó)標(biāo)法檢測(cè)植酸酶活力。植酸酶保存率（%）=顆粒料植酸酶活力/粉料植酸酶活力×100。