纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、其酶學(xué)性質(zhì)及對(duì)飼料粗纖維降解效果的研究

■胡艷平 王 磊 曹平華 胡雄兵 方明建 陳玉林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

纖維素是地球上最豐富的可再生資源[1],而秸稈纖維素占有很大的比例。由于天然纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜和不易降解，對(duì)它的開發(fā)利用卻有限，造成了資源的很大浪費(fèi)[2]；如何將這些秸稈纖維素轉(zhuǎn)化為可被畜禽利用的飼料成為我們研究的熱點(diǎn)，而尋找可有效分解秸稈纖維素的纖維素分解菌，并以此得到足量的纖維素分解酶是一個(gè)有效途徑[3]。纖維素酶既能有效地分解纖維素，又不會(huì)造成環(huán)境污染。自20世紀(jì)初Seillieve發(fā)現(xiàn)蝸牛消化液纖維素酶以來(lái)，纖維素酶的生物降解作用便成了關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。關(guān)于微生物資源，研究得最多的是真菌，但其不足之處在于其菌劑難保存或難將其制成菌劑，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，陸續(xù)出現(xiàn)了芽孢細(xì)菌可有效降解纖維素的報(bào)道，產(chǎn)芽孢細(xì)菌因芽孢的形成，具有適應(yīng)性強(qiáng)、作用底物廣泛及耐高溫的明顯優(yōu)勢(shì)[5]。提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性可提高反應(yīng)溫度，加快降解速度、節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，所以研究耐熱纖維素酶及其產(chǎn)生菌具有重要的實(shí)用價(jià)值，而秸稈纖維素的微生物降解是作為秸稈發(fā)酵飼料的最有前景的方法之一，產(chǎn)酶菌株直接作用于秸稈纖維素又是微生物降解中一項(xiàng)最基礎(chǔ)的研究工作，但這種研究目前并不多見。因此，本試驗(yàn)從桑天牛排泄物中分離、篩選出產(chǎn)耐熱纖維素酶的芽孢桿菌，對(duì)其種屬進(jìn)行鑒定，并研究其酶學(xué)特性和對(duì)麩皮、麥草秸稈、燕麥秸稈3種飼料粗纖維的降解效果，為該菌商業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶奠定基礎(chǔ)，并為秸稈纖維素的高效利用，解析其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

桑天牛幼蟲采自陜西省安康市桑種場(chǎng)桑樹種植基地，收集其排泄物保存于4℃冰箱中備用。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α購(gòu)自北京天根生物公司，載體pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 L，用緩沖液調(diào)至不同pH值，121℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g、酵母抽提物5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：每50 ml種子培養(yǎng)基中各加入2.00 g麩皮、麥草秸稈、燕麥草粉，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 酶和試劑

基因組提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司，TA克隆試劑盒購(gòu)自Promega公司，Taq酶及生化材料購(gòu)自Takara公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；NaCl、NaOH、H2SO4、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸、剛果紅、酚酞、甲基紅等購(gòu)自西安沃爾森、楊凌三利化玻儀器公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及篩選

稱取0.1 g桑天牛排泄物溶于1 ml滅菌水中，10倍稀釋后，取0.1 ml涂布于篩選培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株劃線分離純化。將各純化菌株梯度稀釋（10-1、10-3、10-5、10-7）后，取適量涂布于篩選CMC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。選取適宜生長(zhǎng)密度的CMC平板，1 mg/ml剛果紅溶液染色1 h,1 M的NaCl溶液脫色30 min，觀察透明圈大小，選擇H/C值（透明圈與菌落直徑大小之比）大的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 纖維素酶活力測(cè)定

將篩選得到的菌株接種到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間后，制備粗酶液，參照文獻(xiàn)[6]測(cè)定羧甲基纖維素酶(CMCase)酶活力，并稍作改進(jìn)。在25 ml透明比色管中加入2 ml 1%的羧甲基纖維素鈉作為底物，預(yù)熱5 min，然后加入0.1 ml粗酶液，水浴5 min，迅速加入2.5 ml 3，5-二硝基水楊酸顯色液終止反應(yīng)，煮沸5 min（另取1管作空白對(duì)照，即在25 ml的比色管中分別加入2 ml 1%的羧甲基纖維素鈉、2.5 ml 3，5-二硝基水楊酸溶液和0.1 ml經(jīng)煮沸30 min滅活的粗酶液，迅速混勻后沸水浴加熱5 min）；冷卻后，定容至10 ml，混勻；用空白管調(diào)零，于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。將在上述條件下每分鐘由底物羧甲基纖維素分解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的纖維素酶量定義為一個(gè)纖維素酶活力單位，用U/ml表示。

1.2.3 菌株種屬的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株平板劃線，觀察其菌落形態(tài)，并經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 菌株16S rDNA鑒定

以菌株的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物(F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，R∶5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')，擴(kuò)增 16S rDNA 片段，克隆到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，PCR和酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序；陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGEM-16S。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株HY3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

將菌株HY3種子液接種于(接種量為2%)50 ml基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)，于不同培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定OD595值和纖維素酶活性。

1.2.4.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株HY3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

將菌株HY3種子液分別接種（接種量為2%）到50 ml初始pH值為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在1.2.4.1確定的適宜培養(yǎng)時(shí)間下，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定OD595值和纖維素酶活性。

1.2.5 纖維素酶特性研究

產(chǎn)酶條件及初始培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，將種子培養(yǎng)液按2%的比例接種于基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)一定時(shí)間后，制備粗酶液。

1.2.5.1 酶促反應(yīng)的最佳溫度及酶的熱穩(wěn)定性

將粗酶液與反應(yīng)底物混合后，分別在30、40、50、60、65、70、75、80、90、100 ℃的溫度下反應(yīng)，測(cè)定酶活力。酶的熱穩(wěn)定性的測(cè)定方法為將粗酶液分別在 30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100℃溫度下保溫1 h后，按常規(guī)方法于最佳反應(yīng)溫度條件下測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理的粗酶液的酶活力100%計(jì)。

1.2.5.2 酶促反應(yīng)的最佳pH值及酶的酸堿穩(wěn)定性

將粗酶液與底物組成的反應(yīng)體系用緩沖液調(diào)至分別為3.5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10的不同pH值，于最佳反應(yīng)溫度條件下測(cè)定粗酶液的纖維素酶活力。酶的酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定方法為將粗酶液于pH值為3.5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的緩沖液中37℃水浴保溫1 h，按常規(guī)方法于最適條件下測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理粗酶液的酶活力100%計(jì)。

1.2.6 菌株HY3對(duì)飼料粗纖維降解效果的研究

產(chǎn)酶條件及初始培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，將種子培養(yǎng)液按2%的比例分別接種到含有2.0 g麩皮、麥草秸稈和燕麥草粉的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每種底物設(shè)置3個(gè)重復(fù)和1個(gè)未加菌液的空白對(duì)照，于37℃、220 r/min分別培養(yǎng)一定時(shí)間后，4℃、5 000 r/min離心10 min制備粗酶液。然后將殘?jiān)哭D(zhuǎn)入已恒重的300目尼龍袋中，恒重后用于測(cè)定粗纖維含量。原料和殘?jiān)掷w維含量用尼龍袋法[7]測(cè)定，并計(jì)算粗纖維降解率。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選(見表1)

表1 纖維素酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，從桑天牛排泄物獲得6株H/C值較大的產(chǎn)纖維素酶的菌株，分別命名為HY1、HY2、HY3、HY4、HY5、HY6，其中菌株HY3的H/C值最大，為6.4。由表1可知，6株菌纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果顯示：菌株HY3的酶活最高，為2.9 U/ml，因此選取菌株HY3作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株HY3的形態(tài)學(xué)鑒定（見圖1）

圖1 革蘭氏染色結(jié)果

菌株HY3在LB平板上37℃培養(yǎng)12 h后，其菌落為橢圓形，邊緣不齊，菌落呈灰白色。革蘭氏染色后，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，有芽孢，革蘭氏陽(yáng)性。

2.2.2 菌株種屬鑒定（見圖2）

以菌株HY3的基因組DNA（圖2-A）為模板，用16S rDNA通用引物擴(kuò)增獲得菌株的16S rDNA基因片段，大小約為1.5 kb（圖2-B）。質(zhì)粒pGEM-16S經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生700 bp片段和800 bp片段（圖2-C），說(shuō)明菌株HY3 16S rDNA被成功克隆和轉(zhuǎn)化。

通過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與地衣芽孢桿菌屬（Bacillus licheniformis）細(xì)菌的16S rDNA序列同源性達(dá)到99%，再根據(jù)該細(xì)菌篩選時(shí)的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，綜合分析確定該菌株為地衣芽孢桿菌屬，命名為Bacillus li?cheniformis HY3。

圖2 細(xì)菌基因組DNA、PCR產(chǎn)物和酶切電泳圖

2.3 菌株HY3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 菌株HY3液體培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線（見圖3）

圖3 菌株HY3生長(zhǎng)曲線

由生長(zhǎng)曲線可知，在4～24 h，曲線呈上升趨勢(shì)；24～30 h時(shí)達(dá)到最高峰，而30 h以后呈緩慢下降趨勢(shì)。所以確定菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在8～24 h之間，因?yàn)閷?duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體活力旺盛，所以應(yīng)選擇培養(yǎng)18 h種子液進(jìn)行接種，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為24 h。

2.3.2 菌體產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間（見圖4）

如圖4所示，纖維素酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律。纖維素酶活力在發(fā)酵8 h后大幅上升，至24 h時(shí)最高，為2.95 U/ml，隨后逐漸降低。該結(jié)果與菌體生長(zhǎng)曲線（圖3）基本一致，因此確定菌株HY3產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.3.3 菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的培養(yǎng)基最佳初始pH值（見圖5）

如圖5所示，菌株在pH值3.0～11的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)；在pH值3.0～6.5范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，纖維素酶活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，pH值為6.0～7.5時(shí)酶活力較高，最高值為2.99 U/ml；當(dāng)pH值大于8時(shí)，其酶活力逐漸降低。表明該菌株在中性偏酸、偏堿（pH值6.0～8.0）環(huán)境中能很好地生長(zhǎng)，并保持較高的產(chǎn)酶量，故確定菌株HY3生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的最適pH值為6.5～7。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)HY3菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

2.4 菌株HY3酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 酶反應(yīng)的最適溫度（見圖6）

圖6 溫度對(duì)酶活力的影響

如圖6所示，在30～70℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高而上升，70℃最高，達(dá)到3.14 U/ml，在70～100℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高而迅速降低，由此說(shuō)明該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶的最適反應(yīng)溫度比報(bào)道的大多數(shù)細(xì)菌和真菌都要高。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性（見圖7）

圖7 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，55℃以下酶的穩(wěn)定性較好，相對(duì)酶活力在80%以上，當(dāng)溫度超過(guò)75℃時(shí)，相對(duì)酶活力隨著溫度的升高而迅速下降，但在90℃保溫1 h后仍有30%以上的活力，說(shuō)明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性較好。

2.4.3 酶反應(yīng)的最適pH值（見圖8）

圖8 pH值對(duì)酶活力的影響

如圖8所示，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在pH值5～9之間有較高的酶活力，pH值為6.5時(shí)酶活力最高，達(dá)到3.18 U/ml。說(shuō)明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶催化活性能適應(yīng)較寬的pH值范圍。

2.4.4 酶反應(yīng)的酸堿穩(wěn)定性（見圖9）

圖9 酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性

如圖9所示，粗酶液在pH值6～8范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力可保持80%以上，pH值小于4.5和大于10時(shí)，該酶的穩(wěn)定性較差，說(shuō)明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)強(qiáng)酸堿的耐受力較差，而在中性偏酸、偏堿條件下具有較好的穩(wěn)定性，適于液體發(fā)酵。

2.5 菌株HY3對(duì)飼料粗纖維降解效果

2.5.1 不同飼料對(duì)菌株HY3產(chǎn)酶的影響（見圖10）

將分別添加有麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈的發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min、37℃搖瓶培養(yǎng)24 h后，制備粗酶液，按常規(guī)方法于70℃(反應(yīng)pH值為6.5)測(cè)定酶活力。結(jié)果如圖10所示，該菌在添加麩皮的培養(yǎng)基中產(chǎn)纖維素酶的能力最強(qiáng)，達(dá)到5.01 U/ml，燕麥草粉次之，麥草秸稈培養(yǎng)基中檢測(cè)到酶活力最低，為3.66 U/ml。說(shuō)明不同培養(yǎng)底物對(duì)菌株HY3的產(chǎn)酶影響比較大，這可能與底物的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)系。

2.5.2 粗纖維降解能力的分析（見表2）

如表2所示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，麩皮、燕麥秸稈和麥草秸稈的粗纖維降解率無(wú)明顯變化(P＞0.05)。其中，麩皮的粗纖維降解率最高，最高為7.41%；麥草與燕麥秸稈的粗纖維降解率在4.89%～5.8%之間。菌株HY3對(duì)3種飼料粗纖維降解率的差異，與3種粗飼料作為不同底物對(duì)菌株HY3產(chǎn)酶的影響密切相關(guān)。麩皮為底物時(shí)，HY3的酶活最高，因此粗纖維的降解率最高，麥草秸稈為底物時(shí)，酶活最低，相應(yīng)的降解率也是最低。

圖10 3種粗飼料對(duì)菌株HY3產(chǎn)酶的影響

表2 不同處理時(shí)間3種飼料粗纖維的降解率（%）

3 討論

3.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定

纖維素酶廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)和微生物中；而天牛蛀食樹木，主要通過(guò)消化纖維素獲得養(yǎng)分[8]，其體內(nèi)纖維素酶一般有內(nèi)源性和外源性兩種。近些年來(lái)，從天牛腸道中篩選出了能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌。曹月青等（2001）從桑粒肩天牛腸道中分離到1株纖維素分解菌[9]；劉晨娟等（2010）從桑粒肩天牛腸道中篩選到能降解纖維素的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌[10]。為從天牛體內(nèi)發(fā)掘新的降解纖維素的微生物，本試驗(yàn)以桑天牛排泄物為材料，利用剛果紅染色產(chǎn)生透明圈的方法進(jìn)行初篩，用DNS法測(cè)定發(fā)酵液酶活進(jìn)行復(fù)篩，篩出1株產(chǎn)纖維素酶的菌株，并采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)其種屬進(jìn)行鑒定，該菌株為地衣芽孢桿菌屬。

3.2 不同發(fā)酵時(shí)間菌株HY3生長(zhǎng)及產(chǎn)酶分析

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，菌株的產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)24 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值。這可能與細(xì)菌所處不同生長(zhǎng)階段有關(guān)，細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（12～24 h）快速增殖，因而表現(xiàn)出酶活急劇上升；菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致細(xì)菌死亡速率大于增殖速率，從而導(dǎo)致菌株在培養(yǎng)36 h后產(chǎn)酶活力的顯著下降[11-12]。

3.3 酶耐熱特性研究

纖維素酶一般作為酶制劑添加到飼料中，由于飼料加工工程的特殊要求，適合于飼料中使用的酶必須具有好的熱穩(wěn)定性，因此對(duì)酶的耐熱性的研究非常必要[13-14]。李旺等（2012）對(duì)耐熱菌B.subtilis DR研究發(fā)現(xiàn)，其最適溫度為50℃[15]；而賀蕓（2006）發(fā)現(xiàn)，嗜熱脂肪芽孢桿菌的最適溫度為66℃[16]。本試驗(yàn)中，通過(guò)分析菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應(yīng)溫度為70℃；在75℃下保溫1 h，其相對(duì)酶活力為65%，在90℃保溫1 h后仍有30%左右的活力，表明該菌分泌的纖維素酶具有較高的耐熱性，顯示出更大的應(yīng)用潛力。

3.4 菌株HY3對(duì)不同粗飼料降解率效果的分析

本試驗(yàn)中，添加麩皮和燕麥秸稈的培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)酶活力較麥草的高，這可能與麩皮和燕麥秸稈所含的營(yíng)養(yǎng)成分較豐富有關(guān)，其所含蛋白質(zhì)分別為14%和19.42%，具有十分豐富的植物蛋白質(zhì)資源[17]，可為菌株提供豐富的碳源和氮源。另外，3種飼料的粗纖維降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)無(wú)明顯差異，但麩皮的粗纖維降解率最高，最高可達(dá)7.41%，麩皮與燕麥秸稈在纖維素降解率所表現(xiàn)出的差異，可能與其纖維素含量有關(guān)，麩皮粗纖維含量較低，僅10%左右，從而表現(xiàn)出較高的粗纖維降解率。而麥草表現(xiàn)出的酶活力和降解率較低，可能與其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密、纖維素含量較高有關(guān)。

3.5 尼龍袋法測(cè)定粗纖維降解率的分析

目前，測(cè)定粗纖維的方法有很多，如近紅外漫反射光譜測(cè)定法、濾袋分析法、二次萃取快速測(cè)定法等。這些方法都能方便、簡(jiǎn)單、快速地測(cè)定飼料中粗纖維的含量，但由于這些方法大多需特定的儀器，價(jià)格昂貴，很難在所有的實(shí)驗(yàn)室中普及應(yīng)用。比較而言，使用尼龍袋法測(cè)定粗纖維，既能減少殘?jiān)D(zhuǎn)移的次數(shù)，縮短試驗(yàn)時(shí)間，又可以保持傳統(tǒng)方法的準(zhǔn)確度。吳秋玨等(2005)[7]對(duì)傳統(tǒng)方法與尼龍袋法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，認(rèn)為選用260目尼龍布測(cè)定粗纖維降解率時(shí)，其結(jié)果與傳統(tǒng)方法差異不大。但本試驗(yàn)中選用300目尼龍布的測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)仍有少量損失。因此，用尼龍袋法測(cè)定粗纖維時(shí)，針對(duì)不同粗飼料（如麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈）選用適宜目數(shù)的尼龍袋尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)通過(guò)剛果紅染色初篩和測(cè)定粗酶液酶活力復(fù)篩，從桑天牛排泄物中篩選到一株能夠分解纖維素的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和細(xì)菌16S rDNA鑒定，該細(xì)菌為地衣芽孢桿菌屬，命名為Bacillus licheniformis HY3。

②菌株HY3的適宜生長(zhǎng)和產(chǎn)酶pH值為6.5～7，生長(zhǎng)和產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h。該菌產(chǎn)生的纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，75℃保溫1 h后仍有65%以上活力，在90℃保溫1 h仍有30%左右的活力，顯著高于報(bào)道水平，屬于耐熱性纖維素酶；在pH值6.5時(shí)酶活最高，而且在較寬的pH值范圍內(nèi)都具有較高的反應(yīng)活性，但對(duì)強(qiáng)酸堿的耐受力較差，在中性條件下具有較好的穩(wěn)定性。

③菌株HY3在添加麩皮的培養(yǎng)基中纖維素酶活性(5.01 U/ml)和對(duì)粗纖維的降解率(7.41%)均最高；在添加麥草的培養(yǎng)基中酶活性和對(duì)粗纖維的降解率均最差；飼料粗纖維的降解率隨時(shí)間的變化不大。