線粒體通透性轉變在?；撬崛狈φT導的細胞凋亡中的作用

■高永超 馮 穎 胡建民

(沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110161)

?；撬崾且环Nβ-氨基酸，在興奮性組織中濃度非常高。盡管?；撬嵩?00多年前就被發(fā)現(xiàn)，但近些年才探討其潛在的生理功能，其中包括滲透調節(jié)、免疫調節(jié)、離子轉運調節(jié)、能量代謝、膽固醇代謝的調節(jié)。

?；撬岬脑S多功能是由其結合產物介導的。最近發(fā)現(xiàn)的結合產物5-牛黃甲基尿苷-tRNA亮氨酸（UUR）是在UUR的擺動位置形成的，可以穩(wěn)定tRNA的反密碼子環(huán)的U-G配對，從而引起UUG的高效解碼。因此，?；撬崛狈p少了UUG依賴性線粒體編碼蛋白合成的速率，從而導致呼吸鏈受損。這些結果表明，?；撬崾怯绊懷趸姿峄途€粒體過氧化物產生率的一個關鍵因素，后者引起電子從呼吸鏈轉移到受氧體。

已有研究證實，?；撬峥勺鳛橐环N細胞保護劑。據(jù)Lang等報道，在T淋巴細胞中添加?；撬峥娠@著抑制Fas蛋白（脂肪酸合成）誘導的DNA片段破裂和凋亡細胞，因為?；撬崛笔Э蓪е录毎蛲鲞^程中的細胞收縮。Lang等研究表明，預防性添加?；撬?，可防止細胞收縮過程中的細胞凋亡級聯(lián)，這說明?；撬岬募毎Ｗo作用與其滲透調節(jié)功能有關。然而，?；撬嵋舱{節(jié)鈣的移動和過氧化物的產生，這是細胞存活的決定因素。因此，本試驗研究在?；撬崛狈Φ男募〖毎?，活性氧自由基和鈣轉移對細胞凋亡啟動的影響。

1 方法

1.1 心肌細胞的制備

乳鼠心肌細胞取自2～3日齡的Wistar大鼠。酶消化后，非心肌細胞先行貼壁。將未貼壁的細胞在培養(yǎng)液中懸浮，并輔以10%胎牛血清和0.1 mM 5-溴-2-脫氧尿苷，培養(yǎng)過夜。次日，換培養(yǎng)液。處理前，新生心肌細胞在37°C培養(yǎng)2 d，然后用含0 mM（空白）、5 mM β-丙氨酸（牛磺酸轉運抑制劑）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2 細胞Ca2+含量

空白組和β-丙氨酸處理組的心肌細胞用2 μM的Indo-1（鈣離子熒光探針），37℃條件下處理20 min，沖洗后，共聚焦顯微鏡觀測鈣的變化。收縮期[Ca2+]i、舒張期[Ca2+]i的峰值和達到90%舒張所需的時間以與對照組的比值表示。數(shù)據(jù)表示為兩種波長的比值（F410/F490），與[Ca2+]i成比例。

1.3 細胞?；撬岷浚€原/氧化型谷胱甘肽水平分析

根據(jù)Schaffer等的報道，離心前，用冰高氯酸（1 M）和2 mM EDTA進行細胞勻漿。上清液用來測細胞內?；撬岷?。谷胱甘肽檢測試劑盒測定氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）水平（開曼化工，美國）。

1.4 Western blot分析

1.4.1 Western blot分析測定細胞色素C水平

根據(jù)Grishko等所描述的方法，細胞在冰的分離緩沖液（pH值7.25，4°C）中裂解和勻漿。先將勻漿800×g離心2次，然后16 000×g離心。上清液部分作為胞質碎片用于確定細胞色素C的含量。以牛血清白蛋白為標準品，雙辛丁酸法進行蛋白濃度測定。樣品與5×電泳上樣緩沖液等體積混合，進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳。轉膜，然后加相應的抗體。ECL化學發(fā)光反應分析。

1.4.2 鈣磷脂結合蛋白V和碘化丙啶檢測

根據(jù)Ricci等的方法，在添加和不添加200 nM環(huán)孢素A（CsA）—線粒體通透性轉換孔（MPT）抑制劑的情況下，細胞分別經0 mM（對照組）、5 mM β-丙氨酸處理48 h，使用TACS膜聯(lián)蛋白V-FITC試劑盒（Trevigen，美國）測定細胞凋亡的數(shù)量。Annexin V和碘化丙啶染色，使用奧林巴斯IX70顯微鏡（奧林巴斯美國公司）倒置顯微鏡觀察熒光。在顯微鏡下對五個獨立的區(qū)域進行明亮的綠色（凋亡）和紅色（壞死）核檢查。

1.5 統(tǒng)計分析

所有結果以平均值±標準差表示。t檢驗進行比較，ANOVA與Tukey的對比試驗相結合處理數(shù)據(jù)。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學顯著。

2 結果

在含有牛磺酸轉運抑制劑——β-丙氨酸（5 mM）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)離體乳鼠心肌細胞48 h后，細胞內牛磺酸水平下降45%。隨著細胞內牛磺酸濃度的減小，凋亡細胞呈時間依賴性增加（見圖1）。

在乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)液中添加?；撬徂D運抑制劑β-丙氨酸（5 mM），每個時間間隔，收集一些細胞檢測?；撬岷?。在其余的細胞中，檢測凋亡細胞的數(shù)量。細胞在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h作為空白對照（0點）。

圖1 細胞?；撬岷考暗蛲黾毎g的關系

幾個通路可以啟動凋亡的級聯(lián)過程，包括受體信號耦合到caspase活化，內質網破壞和兩種類型的線粒體通透性轉變（均釋放凋亡因子，如線粒體中細胞色素C）。因此，為了確定線粒體通透性改變是否參與β-丙氨酸介導的細胞凋亡，檢測了線粒體中細胞色素C的釋放。如圖2所示，?；撬崛狈Φ男募〖毎|中細胞色素C的總量是空白對照組的5倍。

圖2 ?；撬崛狈毎麧{中細胞色素C水平（細胞色素C）

線粒體通透性轉換有兩種機制。一種是線粒體通透性轉換孔，簡稱為MPT，是跨越線粒體內外膜的一個通道。另一種機制，通過Bax和Bak蛋白的激活增加線粒體外膜通透性。我們通過應用MPT抑制劑——環(huán)孢素A，分析MPT在β-丙氨酸介導的細胞凋亡中的作用。如圖3所示，環(huán)孢素A完全阻止了β-丙氨酸介導的細胞凋亡，而對空白對照組的細胞凋亡無影響。盡管細胞色素C從線粒體外膜通透性增加的細胞中也釋放出來，但Bax蛋白介導的通透性轉換沒有增加β-丙氨酸介導的細胞凋亡，因為磷酸化的Bad水平增加而Bcl-2/Bax的比值并沒有變化。綜上所述，這些數(shù)據(jù)說明β-丙氨酸介導的細胞凋亡中，MPT的激活是一個重要的引發(fā)劑。

圖3 在β-丙氨酸處理的細胞中，線粒體通透性轉變的啟動

[Ca2+]i升高和過度的氧化應激導致MPT通道的開放。線粒體基質中的鈣離子結合位點是MPT開放的觸發(fā)器。鈣介導的線粒體損傷與線粒體和胞質中的Ca2+大量聚積有關。由于新生兒心肌細胞的線粒體和細胞質中[Ca2+]i的波動大致相同，因此可以通過檢測心肌細胞的鈣離子濃度的變化來研究?；撬崛狈€粒體游離Ca2+的影響。圖4顯示了?；撬岬南膶a2+周期的主要作用是心肌細胞舒張期的延長，90%舒張時間增加至260%。同時，在牛磺酸缺乏的心肌細胞中，舒張期Ca2+含量與對照組相比沒有發(fā)生變化，而收縮期鈣離子濃度與對照組相比下降了14%。

由于心臟舒張和收縮時[Ca2+]i僅有輕微的變化，在?；撬崛狈Φ募毎?，Ca2+超載不可能是MPT開放的重要原因。因此，檢測了線粒體氧化應激是否造成線粒體MPT孔的開放。如圖5所示，?；撬崛狈Π殡S著GSH/GSSG下降45%。因為在低GSH/GSSG的比值時MPT孔開放，在?；撬崛狈Φ男募〖毎?，氧化應激可是觸發(fā)細胞凋亡的主要原因。

圖4 ?；撬崛狈︹}變化的影響

圖5 牛磺酸缺乏細胞中，還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值減小

3 討論

貓飲食中缺乏?；撬岷痛笫笕狈ε；撬徂D運體，會導致心肌病的發(fā)展，其機制尚不清楚。本研究中的結果表明?；撬崛狈r細胞凋亡會導致心肌功能障礙。

細胞凋亡是線粒體疾病的一個共同特征。在大多數(shù)MELAS（線粒體腦肌病，乳酸性酸中毒和卒中樣發(fā)作）的情況下，tRNALeu(UUR)的D-環(huán)的一個突變減少了tRNA擺動位置的尿苷翻譯后修飾。

由于tRNALeu(UUR)的翻譯后修飾使得tRNALeu(UUR)的反密碼子環(huán)的U-G配對穩(wěn)定，MELAS與UUG的低效解碼、抑制依賴UUG的線粒體編碼蛋白的合成和減少呼吸鏈活性有關。呼吸鏈復合物活性降低導致ATP產生減少，同時由于電子從電子傳遞鏈轉移給受體氧形成了超氧陰離子自由基導致氧化應激增加。因此，MELAS和?；撬崛狈Χ寂c過氧化物產生增多有關。然而，在?；撬崛狈Φ那闆r下，tRNALeu(UUR)翻譯后修飾為5-牛黃甲基尿苷-tRNA亮氨酸（UUR）的底物（牛磺酸）減少；而在MELAS，tRNALeu(UUR)的突變改變了tRNA的結構，導致了擺動位置尿苷翻譯后修飾的缺陷。

線粒體對氧化損傷高度敏感。線粒體氧化的靶點是線粒體DNA（mtDNA）。盡管線粒體中存在DNA修復系統(tǒng)可以修復線粒體DNA，但是修復系統(tǒng)能被壓制，造成嚴重的線粒體DNA氧化損傷，引發(fā)突變或損害線粒體編碼蛋白的轉錄。因為減少線粒體編碼蛋白的表達可以進一步減少電子轉運通量，增加氧化應激，線粒體蛋白合成受損的惡性循環(huán)。這些導致MPT的開放和細胞凋亡的啟動。此外，在發(fā)生氧化應激的細胞中，關鍵蛋白的氧化促進了MPT的開放和細胞凋亡。關鍵蛋白包括腺嘌呤核苷酸移位酶，它參與調節(jié)MPT通道的開放和促進線粒體呼吸鏈的組成部分過氧化物的產生。

本研究在牛磺酸缺乏的心肌細胞中，以谷胱甘肽氧化還原態(tài)作為一個氧化應激指標。然而，最近的研究表明，谷胱甘肽氧化還原比值（GSH/GSSG）不僅僅是一個氧化應激指標，而且還是氧化應激的決定因素。據(jù)Aon等研究，GSH/GSSG比值與細胞的膜電位和線粒體NADH/NAD比值相關。在GSH/GSSG的比例非常低時，細胞的膜電位降低，MPT開放。在這方面，線粒體中谷胱甘肽過氧化物1的過度表達對細胞保護起著重要作用，GSH和谷胱甘肽過氧化物酶對細胞保護的一個關鍵步驟是對有毒的氧化劑的清除。這些數(shù)據(jù)與目前發(fā)現(xiàn)一致，GSH/GSSG比值下降與MPT開放有關，線粒體細胞色素C的釋放與細胞凋亡級聯(lián)啟動有關。

文章出處：C J Jong,J Azuma,S W Schaffer.Role of mitochondrial permeability transition in taurine deficiency-induced apoptosis.Exp Clin Cardiol,2011,16(4)：125-128.