黑曲霉發(fā)酵醬油渣的研究

■李 鵬 馬 良 范 寰 王文杰

(天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112)

醬油渣又稱醬渣，是制作醬油后的殘?jiān)錉I(yíng)養(yǎng)豐富，粗蛋白含量約為25%，粗脂肪9.7%、粗纖維13.5%、灰分10.5%[1]，還含有豐富的異黃酮。但其含鹽量約7%，鮮渣含水量約70%，因此鮮渣易變質(zhì)，不宜貯藏[2]，直接用作飼料易造成禽畜食鹽中毒、吸收效率低等問題。目前，醬油渣微生物改造主要是利用曲霉和酵母菌以及一些光合細(xì)菌提高其蛋白含量[3-4]，而其中粗纖維尤其是木質(zhì)素的降解研究還未見報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)黑曲霉的耐鹽能力和其對(duì)醬油渣發(fā)酵飼料化改造進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger），購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試驗(yàn)原料

醬油渣由天津市某醬油廠提供，初水含量為76.35%。

1.1.3 主要儀器或設(shè)備

VELP纖維素分析儀、FOSS蛋白測(cè)定儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉耐鹽性研究

在無(wú)菌條件下，用接種針于斜面培養(yǎng)基中取適量菌種，點(diǎn)接到含NaCl濃度分別為0、10、20、30、40、80、120 g/l的 PDA培養(yǎng)基于平皿正中央，于28℃、濕度70%的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。接種后每隔12 h采用十字法測(cè)定黑曲霉菌落直徑。

1.2.2 黑曲霉種子培養(yǎng)液的制備

從PDA試管中取10環(huán)接種到含有50 ml PDA液體培養(yǎng)基的100 ml三角燒瓶中，搖勻后，置于28℃、濕度為70%的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，為黑曲霉一級(jí)種，再以5%的接種量接種到裝有100 ml PDA液體培養(yǎng)基的250 ml三角燒瓶中，29℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h，為黑曲霉二級(jí)種[5]。

1.2.3 黑曲霉發(fā)酵醬油渣試驗(yàn)

將黑曲霉二級(jí)種接入裝有50 g醬油渣的無(wú)菌三角燒瓶中，每瓶接入種子液5 ml，28℃、濕度為70%培養(yǎng)。待黑曲霉布滿醬油渣時(shí)隨機(jī)取樣，而后每隔3 d取1次樣，每次取樣3個(gè)重復(fù)，連續(xù)發(fā)酵30 d。樣品121℃、高壓滅活30 min后于65℃烘48 h，回潮48 h，測(cè)定樣品水分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量。以含有5 ml黑曲霉二級(jí)種子液的未發(fā)酵醬油渣作為對(duì)照。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

干物質(zhì)采用國(guó)標(biāo)GB/T 6435—2006的方法測(cè)定水分含量，計(jì)算干物質(zhì)含量；中性洗滌纖維含量采用GB/T 20806—2006的范氏法；酸性洗滌纖維含量采用農(nóng)業(yè)部NY/T 1459—2007的方法測(cè)定；酸性洗滌木質(zhì)素含量采用國(guó)標(biāo)GB/T 20805—2006的方法測(cè)定；粗蛋白含量采用GB/T 6432—94的凱氏定氮法，利用FOSS-2300全自動(dòng)凱氏定氮分析儀測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

式中：X——各物質(zhì)成分降解率（%）；

A——發(fā)酵前成分總量；

B——發(fā)酵后成分總量。

結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件DPS7.55進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's新極復(fù)差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)速率的影響

按照1.2.1的試驗(yàn)方法研究，測(cè)定黑曲霉的菌落直徑，繪制其生長(zhǎng)速率，其生長(zhǎng)速率隨NaCl濃度變化的擬合曲線如圖1。

圖1 黑曲霉在不同NaCl濃度下的生長(zhǎng)速率曲線擬合圖

由圖1可知，NaCl在0～120 g/l這個(gè)區(qū)間，黑曲霉的生長(zhǎng)速率隨NaCl的增加，大致呈三階多項(xiàng)式形式變化，擬合曲線方程和相互系數(shù)分別為：y=0.000 004x3-0.001x2+0.062 2x+0.958 8，R2=0.973。由擬合曲線可知，黑曲霉的生長(zhǎng)速率先隨NaCl的增加而增加，在40 g/l時(shí)達(dá)到最大值2.08 cm/d，而后再隨NaCl濃度的增加而減小，NaCl濃度在80 g/l以內(nèi)，黑曲霉生長(zhǎng)速率基本不受NaCl濃度的抑制。由于試驗(yàn)用濕醬油渣含有1.87%的NaCl，因此黑曲霉可用于醬油渣的發(fā)酵改造。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵醬油渣的影響

按照1.2.4的試驗(yàn)方法檢測(cè)黑曲霉發(fā)酵處理醬渣中各成分含量的變化。通過(guò)測(cè)定樣品中水分、粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)，結(jié)果見表1，計(jì)算干物質(zhì)(DM)、半纖維素(HC)、纖維素(CEL)和酸性洗滌木質(zhì)素降解率，繪制降解率隨時(shí)間變化的曲線如圖2。

由表1可知，醬油渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵處理30 d后，粗蛋白含量從27.06%增加到了34.59%，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性木質(zhì)素、半纖維素和纖維素均有所降低，分別從46.89%、38.4%、14.11%、8.49%、23.94%降低到了36.57%、30.51%、11.46%、6.06%、19.05%。

表1 黑曲霉發(fā)酵醬渣各成分含量(%)

圖2 黑曲霉發(fā)酵醬油渣成分降解率

由圖2知，醬油渣接入黑曲霉后，第3 d黑曲霉孢子布滿醬油渣，其干物質(zhì)降解率隨時(shí)間變化呈三階多項(xiàng)式形式變化，其線性方程為y=0.002 4x3-0.129 1x2+2.433 9x，R2=0.977 4。半纖維素降解率到第3 d時(shí)達(dá)到了70.54%，而第3 d到30 d變化不明顯，降解率由70.54%增加到84.28%，僅增加了13.74%。纖維素降解率基本上呈線性的形式增加，其線性方程和相關(guān)系數(shù)為y=0.816 1x，R2=0.974 3，30 d時(shí)，降解率為23.86%。由線性方程可知，黑曲霉降解纖維素的能力也較強(qiáng)，尤其是在發(fā)酵后期(18～30 d)，其降解率不斷增加，超過(guò)干物質(zhì)的降解率。酸性洗滌木質(zhì)素降解率也呈線性形式變化，其線性方程和相關(guān)系數(shù)為：y=0.310 5x，R2=0.939 7，由方程可知，黑曲霉降解木質(zhì)素能力較弱，到30 d時(shí)，降解率僅為9.43%。由此可見，黑曲霉能有效降解醬油渣中的半纖維素和纖維素，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

有研究表明[7]，黑曲霉降解稻草中的木質(zhì)纖維素具有階段性，在初級(jí)階段，黑曲霉主要進(jìn)行纖維素、半纖維素的降解，合成木質(zhì)素降解酶系；生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)入次級(jí)代謝，分泌酶，開始木質(zhì)素的代謝，進(jìn)行木質(zhì)素的分解；同時(shí)各組分均有一定程度上的降解。在本試驗(yàn)中黑曲霉優(yōu)先降解半纖維素，然后降解纖維素，同時(shí)木質(zhì)素也得到一定程度的降解。

3 結(jié)論

NaCl濃度在0～120 g/l以內(nèi)的PDA培養(yǎng)基上，黑曲霉的生長(zhǎng)速率先隨NaCl的增加而增加，到40 g/l時(shí)達(dá)到最大值2.08 cm/d，然后再隨NaCl濃度的增加而減小，NaCl濃度在80 g/l以內(nèi)，黑曲霉生長(zhǎng)速率基本不受NaCl的抑制。試驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉適合作為醬油渣的發(fā)酵菌株。

黑曲霉能高效降解醬渣中半纖維素，30 d降解率達(dá)到了84.28%；同時(shí)黑曲霉對(duì)纖維素和木質(zhì)素也有一定程度降解，30 d時(shí)對(duì)纖維素和木質(zhì)素降解率分別為23.86%和9.43%。