牛精原干細(xì)胞研究進(jìn)展

王春偉，扶曉波，呂 妍，趙 軍，郭秋萍，張衛(wèi)藝，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

精子發(fā)生是雄性動(dòng)物終身產(chǎn)生大量精子的一個(gè)過(guò)程，其特點(diǎn)是由二倍體生殖細(xì)胞(精原干細(xì)胞)的單向分化，通過(guò)減數(shù)分裂形成精母細(xì)胞，最后產(chǎn)生單倍體配子精子[1]。精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳動(dòng)物出生后唯一能進(jìn)行自我更新并將遺傳信息傳遞給后代的具有像胚胎干細(xì)胞一樣增殖和分化潛能的干細(xì)胞[2]。精原干細(xì)胞的建立，不僅提供了一種新的工具來(lái)分析精子發(fā)生或干細(xì)胞的自我更新，同時(shí)也開(kāi)辟了干細(xì)胞實(shí)際應(yīng)用的新領(lǐng)域。本文通過(guò)分析牛精原干細(xì)胞分離純化、培養(yǎng)鑒定、冷凍保存和誘導(dǎo)分化的研究現(xiàn)狀，指出目前存在的主要問(wèn)題，并展望其應(yīng)用前景，以期為精原干細(xì)胞的研究提供借鑒。

1 牛精原干細(xì)胞的發(fā)生

精原干細(xì)胞位于睪丸曲細(xì)精管的上皮基底膜上，由四周的支持細(xì)胞緊密連接，主要參與精子發(fā)生，通過(guò)自我更新維持生殖干細(xì)胞穩(wěn)定或自我分化成一定數(shù)量的精母細(xì)胞，并最終發(fā)育成精子，保證雄性動(dòng)物正常的生殖能力。精原干細(xì)胞起源于原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)，而PGCs起源于胚胎外胚層細(xì)胞。PGCs從尿囊基部沿后腸遷移到雙側(cè)生殖腺嵴，在雄性生殖腺嵴PGCs被支持細(xì)胞的前體細(xì)胞所包圍，然后與支持細(xì)胞一起形成生殖索。PGCs演化為生殖母細(xì)胞(性原細(xì)胞)，即精原干細(xì)胞的前體細(xì)胞。雄性動(dòng)物睪丸曲細(xì)精管中存在As(single)、Apr(paired)、Aal(aligned)、A1、A2、A3、A4等多個(gè)時(shí)期的細(xì)胞[2]。精原干細(xì)胞的發(fā)育順序?yàn)锳s-Apr-Aal-A1-A2-A3-A4-I-B-Spc。As型(type-A single spermatogonia)細(xì)胞為精子發(fā)生過(guò)程中的干細(xì)胞，是成體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干細(xì)胞[3]。在體內(nèi)，基于超微結(jié)構(gòu)特征可將牛的精原細(xì)胞前體細(xì)胞分為基地干細(xì)胞(BSCs)、集合精原細(xì)胞前體細(xì)胞(ASPCs)和定向精原細(xì)胞前體細(xì)胞(CSPCs)三類。其中BSCs見(jiàn)于25和30周齡的犢牛睪丸內(nèi)，而在成年牛睪丸內(nèi)數(shù)量很少。BSCs呈圓形，有一格位于胞質(zhì)中央的核。在25周齡的犢牛睪丸內(nèi)，多數(shù)生精細(xì)胞屬ASPCs，一般多個(gè)緊密相鄰存在。CSPCs一般具有核周體和胞質(zhì)突起，核的輪廓呈球形或卵圓形。

2 牛精原干細(xì)胞的分離純化

精原干細(xì)胞的生物學(xué)研究需要大量高活性、高純度的細(xì)胞。但是，睪丸中精原干細(xì)胞的數(shù)量非常少，需要成熟的分離和純化技術(shù)。目前分離精原干細(xì)胞的常用方法有機(jī)械分離法、組合酶分離法等。牛精原干細(xì)胞常用的分離方法是在兩步酶消化法和Percoll分離法的基礎(chǔ)上進(jìn)行。Yang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械法與酶消化法相結(jié)合比單純使用機(jī)械法的活細(xì)胞獲得率提高約9倍。在分離方法中，采用不同的酶進(jìn)行消化，例如分散酶、胰蛋白酶及IV型膠原酶等，也可單用或多種酶聯(lián)合使用，通過(guò)兩步法消化獲得精原干細(xì)胞[5-6]。目前常用的純化方法主要有差速貼壁法[5]、磁激活分選[7]等。Lzadyar等[8]結(jié)合差異貼壁和Percoll密度梯度離心法得到了純度為73 %的小牛A型精原細(xì)胞。

3 牛精原干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定

3.1 精原干細(xì)胞的培養(yǎng)

體外大量增殖培養(yǎng)精原干細(xì)胞是研究細(xì)胞功能的基本要求。Aponte等[9]采用小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行牛精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)，使精原干細(xì)胞增殖10000倍，但僅能培養(yǎng)1個(gè)月。飼養(yǎng)細(xì)胞層可以支持精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有MEF(mouse embryonic fibroblasts)細(xì)胞[5]、STO(SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant)細(xì)胞[7]等。Kubota等[10]選用體外精原干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)層對(duì)于精原干細(xì)胞必不可少。Lzadyar等[8]研究發(fā)現(xiàn)，適量的血清可以明顯改善精原干細(xì)胞的存活和增殖情況，但高濃度的血清會(huì)導(dǎo)致精原干細(xì)胞的分化[7,11]。在一些非支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，常需要添加乳酸鹽和丙酮酸鹽[12]。根據(jù)所選基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同，有時(shí)候還需要添加 Hepes、谷氨酰胺、非必須氨基酸等[13]；生長(zhǎng)因子如GDNF和LIF等，也可促進(jìn)精原干細(xì)胞體外擴(kuò)增[14-15]。

3.2 精原干細(xì)胞的鑒定

精原干細(xì)胞的鑒定主要包括形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞表面特異性標(biāo)記鑒定和干細(xì)胞功能鑒定等。

對(duì)于多數(shù)哺乳動(dòng)物而言，精原干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征是較睪丸體細(xì)胞體積大，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞間由間橋連接，胞核較大，核仁常位于中央。顆粒較少，核不明顯，常見(jiàn)2個(gè)或多個(gè)[16]。常用的染色鑒定的方法有AP染色法、免疫熒光染色法[17-18]、堿性磷酸酶染色法[19]。在基因鑒定方面，精原干細(xì)胞具有與其他干細(xì)胞相似的一些標(biāo)志物，例如Oct4、Thy-1、β1-integrin和α6-integrin、CD9、CD2為陽(yáng)性；CD51、MHC-I、c-kit、Sca、CD34為陰性。未分化的A型精原細(xì)胞標(biāo)志有Ngn3+基因[20]、C-Ret[20]、CDH1[21]、PGP9.5[22]等。GFRA1、OCT-4、c-Ret是目前體外鑒定精原干細(xì)胞常用的表面標(biāo)志物。Prdm1和Dppa3是早期生殖細(xì)胞標(biāo)志基因[23]。Thy-1、GFRa-1、c-kit為精原干細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同階段表達(dá)的部分標(biāo)志物[24]。CD133、VASA、DAZL和TSPYL2等在精原干細(xì)胞中特異性表達(dá)[25]。Foxo1是未分化精原干細(xì)胞的表面標(biāo)志，對(duì)于維持精原干細(xì)胞的穩(wěn)定和啟動(dòng)精子發(fā)生過(guò)程有重要作用，F(xiàn)oxo1、Foxo3和Foxo4，可維持精原干細(xì)胞功能[26]。Stra8是哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞有絲分裂變?yōu)闇p數(shù)分裂前的特異表達(dá)基因[27]。

4 牛精原干細(xì)胞的冷凍保存

精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)與冷凍保存技術(shù)相結(jié)合，為保護(hù)珍稀動(dòng)物和優(yōu)良家畜遺傳資源提供又一條新的途徑[28]。常用的抗凍劑可以分為滲透性抗凍劑和非滲透性抗凍劑。滲透性冷凍保護(hù)劑主要有甘油(Glycerol)、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)、丙二醇(Propylene glycol, PROH)、乙二醇(Ethyleneglycol, EG)、木糖醇、乙酰胺、阿東糖醇等。非滲透性保護(hù)劑主要有蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalase)、聚蔗糖(Ficoll)、葡聚糖(Dextran)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone, PVP)、聚已二醇(Polyethylene glycol, PEG)以及白蛋白(Albumin) 等。鄭鵬等[29]研究發(fā)現(xiàn)，以10%的二甲基亞砜為冷凍劑冷凍保存精原干細(xì)胞效果最好；冷凍保存支持細(xì)胞以10%乙二醇和0.1 mmol/L海藻糖組合冷凍效果最好；Izadyar等[30]表明，使用含有MEM+10%FCS+10%DMSO+0.07M蔗糖的凍存液，采用慢速降溫冷凍方式，冷凍復(fù)蘇后可獲得70%以上的細(xì)胞活率；馬良宏等[31]采用常規(guī)方法冷凍保存的精原干細(xì)胞移植后仍保持其增殖分化和形成成熟精子的能力；丁曉麟等[32]采用非程控降溫方法凍存精原干細(xì)胞后，復(fù)溫后細(xì)胞能夠快速增殖。

5 牛精原干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

Sato[33]和Takashi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，精原干細(xì)胞有歸巢行為和克隆形成的能力，這些均與微環(huán)境分泌的趨化因子有關(guān)，如膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell-line derived neurotrophic factor, GDNF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal-derived factor 1, SDF-1)，從而探究精原干細(xì)胞在曲細(xì)精管中的行為。Kanatsu-Shinohara等[35]成功將新生小鼠SSCs誘導(dǎo)為胚胎干細(xì)胞樣(ES-like)細(xì)胞。Guan等[36]收集成年小鼠的SSCs，在特定的培養(yǎng)條件下也具有了ES的特性，并將這些細(xì)胞命名為多能性成體生殖干細(xì)胞(maGSCs)。Simon等[37]首次報(bào)道將新生SSCs置于誘導(dǎo)性微環(huán)境轉(zhuǎn)分化為三個(gè)胚層的組織。Kossack等[38]發(fā)現(xiàn)SSCs表達(dá)與胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物相似的標(biāo)志，表明SSCs具有類似ES的多潛能性。目前，關(guān)于牛精原干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方面的研究較少，但已經(jīng)初步建立牛精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系及體外分析鑒定牛精原干細(xì)胞分化能力的基本方法。

6 牛精原干細(xì)胞研究存在的主要問(wèn)題

動(dòng)物睪丸中精原干細(xì)胞的數(shù)量和比例很低，隨著年齡的增加，精原干細(xì)胞比例明顯降低，所以獲得并富集精原干細(xì)胞的難度增加。牛出生后5～7月齡更容易獲得大量精原干細(xì)胞[39]。精原干細(xì)胞的分裂增殖需要適宜的環(huán)境和良好的條件，溫度、細(xì)胞因子都對(duì)精原干細(xì)胞的分裂增殖有影響[3]。目前精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)存在爭(zhēng)議[40]，培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，含有各種生長(zhǎng)因子，對(duì)SSCs作用不清楚，不利于精原干細(xì)功能的研究，需要找到更合適的培養(yǎng)基。對(duì)小鼠等模式動(dòng)物精原干細(xì)胞的培養(yǎng)已經(jīng)成熟，但對(duì)牛等家畜大動(dòng)物的精原干細(xì)胞的特定的培養(yǎng)技術(shù)體系仍處于探索階段。因此，需要深入研究牛的精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，探究精原干細(xì)胞的自我更新和分化機(jī)制，實(shí)現(xiàn)牛精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。

目前利用雄性精原干細(xì)胞介導(dǎo)的技術(shù)已經(jīng)制備出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[41]，為瀕危動(dòng)物的保種[42]提供高效而簡(jiǎn)便的途徑。近年來(lái)，精原干細(xì)胞開(kāi)始應(yīng)用于研究治療原發(fā)性無(wú)精子癥，對(duì)于解決雄性不育等問(wèn)題具有廣闊的應(yīng)用前景[43]。精原干細(xì)胞增殖培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與動(dòng)物育種技術(shù)相結(jié)合，將會(huì)大規(guī)模的生產(chǎn)優(yōu)良家畜，為人類帶來(lái)優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物產(chǎn)品。精原干細(xì)胞的冷凍保存與移植技術(shù)的聯(lián)合有重要的實(shí)踐意義。在醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)方面，精原干細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化的研究具有重要的理論意義及廣闊的應(yīng)用前景。

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