氮溴化丙錠與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合的細(xì)菌活細(xì)胞檢測(cè)方法

史 菊（江蘇省泗洪縣人民醫(yī)院，江蘇 泗洪 223900）

疊氮溴化乙錠（EMA）不能穿過完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來的DNA結(jié)合，最終阻斷DNA分子的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），可用于PCR檢測(cè)中區(qū)分死活菌。但是，EMA具有細(xì)胞毒性，使其在臨床診斷和食品安全中的應(yīng)用受到一定的限制[1]。在細(xì)菌死活細(xì)胞的PCR選擇性擴(kuò)增中，使用無細(xì)胞毒性的PMA代替EMA與PCR結(jié)合，對(duì)PMA對(duì)細(xì)胞致死作用進(jìn)行有效的分析，同時(shí)對(duì)PMA的抑制作用進(jìn)行考察，分析在死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增中，PMA交聯(lián)受濁度、曝光時(shí)間以及最適濃度的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：菌種為大腸桿菌Escherichia coli ATCC 8739，運(yùn)用LB液體培養(yǎng)在160 r/min、30℃下進(jìn)行24 h的培養(yǎng)。試劑為PMA（美國Biotium公司）；細(xì)菌通用引物1492R（5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3′）和27F（5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′）；脫氧核糖核酸（dNTPs）、Taq酶等PCR反應(yīng)體系（TaKaRa公司）。儀器用PCR儀器（Eppendorf公司）；Gel Doe 2000型凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）。

1.2 方法：①試驗(yàn)樣品：取24 h培養(yǎng)的E.coli菌懸液10 ml，5000 g離心5 min，兩次懸浮1.5%的NaCl溶液，對(duì)其進(jìn)行稀釋得到108 ml-1的菌體細(xì)胞數(shù)；②PMA處理：用二甲亞砜溶解PMA，配置成0.5 mg/ml的PMA溶液，避光，保存于-20℃冰箱。取500μl的菌懸液，置于1.5 ml離心管中，然后加入3μl 0.5 mg/ml的PMA溶液，控制PMA的終質(zhì)量濃度為3μg/ml；充分混勻，避光培養(yǎng)5 min。用500 W的鹵素?zé)羝毓猓瑫r(shí)間為5 min，在冰上放置光照交聯(lián)的樣品，距光源距離為20 cm；懸浮液交聯(lián)后10000 g離心，時(shí)間為5 min，得出沉淀并提取DNA[2]。此外，對(duì)于活細(xì)胞、死細(xì)胞的PMA處理中，進(jìn)行PMA處理的為試驗(yàn)組，而沒有進(jìn)行PMA處理的為對(duì)照組；③PMA曝光交聯(lián)的濁度試驗(yàn)：3μl PMA分別為加入500μl濁度為0、1、5、10、50、100 NTU的熱致死細(xì)胞懸浮液中，PMA的終質(zhì)量濃度為3μl/ml，熱致死細(xì)胞懸浮液未經(jīng)PMA處理的為對(duì)照組。3 min光照后進(jìn)行PMA曝光交聯(lián)，對(duì)PMA光照交聯(lián)受濁度的影響進(jìn)行考察；④不同條件制備死細(xì)胞的PMA處理；⑤DNA提取與PCR反應(yīng)：曝光交聯(lián)PMA后，懸浮液10000 g離心，運(yùn)用超純水對(duì)沉淀進(jìn)行兩次重懸浮。對(duì)2×細(xì)胞裂解液進(jìn)行加入，在沸水浴中煮沸10 min，使裂解細(xì)胞。懸浮液10000 g離心冷至室溫后，在微量離心管中進(jìn)行上清液的轉(zhuǎn)入，保存溫度為-20℃。PCR反應(yīng)體系為50μl，5μl 10×PCR緩沖液，0.5μl正反向引物，5μl上述上清液，41.7 nmoL/s Taq DNA聚合酶，4μl脫氧核糖核苷酸，用超純水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)的程序：第一步，預(yù)變性：溫度是94℃，時(shí)間為5 min；第二步為30個(gè)循環(huán)：94℃，30 s變性；55℃，退火1 min；72℃，延伸1.5 min。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同SYBR Green I核酸染料對(duì)凝膠進(jìn)行染色，通過Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。運(yùn)用Image J軟件，對(duì)瓊脂糖凝膠上DNA條帶密度進(jìn)行定量分析[3]。

2 結(jié)果

2.1 死細(xì)胞的PMA處理：對(duì)于沒有進(jìn)行PMA處理的一組中，通過紫外燈照射、熱、異丙醇處理，對(duì)E.coli死細(xì)胞進(jìn)行獲得，其DNA的PCR擴(kuò)增差異并不明顯。另一組試驗(yàn)對(duì)PMA處理進(jìn)行了添加，得到的E.coli活細(xì)胞，其DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上一組相比，條帶密度相差甚微，依據(jù)這一點(diǎn)，可以得知PMA處理不會(huì)對(duì)E.coli活細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增造成影響。70%異丙醇處理10 min與75℃水浴10 min得到的E.coli死細(xì)胞，在PMA處理后，PMA會(huì)對(duì)其DNA的PCR擴(kuò)增進(jìn)行抑制，也就是說對(duì)于E.coli死細(xì)胞中DNA的PCR擴(kuò)增，PMA具有較好的抑制能力。借助紫外燈進(jìn)行10 min的照射，使E.coli細(xì)胞死亡，不過PMA處理死細(xì)胞后，PMA就不會(huì)對(duì)其DNA的PCR擴(kuò)增造成影響。分析這一原因，主要是因?yàn)楫惐?、紫外照射與熱造成的細(xì)胞死亡形成的原理有所差異，熱和異丙醇通過處理會(huì)對(duì)生物細(xì)胞的細(xì)胞膜造成破壞使其死亡，而紫外照射的處理會(huì)使細(xì)胞中核酸的結(jié)構(gòu)受到損害，但細(xì)胞膜不會(huì)受到大的影響，其中PMA無法透過完整的細(xì)胞膜，與DNA進(jìn)行結(jié)合。

2.2 PMA處理熱致死細(xì)胞/活細(xì)胞混合樣品的效果：對(duì)照組中沒有進(jìn)行PMA處理，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。試驗(yàn)顯示，活菌受PMA的影響比較的小；如果活菌數(shù)＜50%，對(duì)照組與PMA處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），也就是說，E.coli熱致死細(xì)胞中，可以通過PMA對(duì)DNA的PCR擴(kuò)增進(jìn)行有效的抑制[4]。

2.3 PMA光照交聯(lián)受濁度的影響：通過分析可知，當(dāng)濁度＜10 NTU時(shí)，對(duì)死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，PMA具備的抑制效用仍然有效；當(dāng)濁度＞100 NTU時(shí)，PMA的抑制效果就會(huì)失去。對(duì)于PMA光照交聯(lián)受濁度的影響而言，光的透過性影響較為重要，其隨著濁度的增大，光的透性就會(huì)變得越弱，而DNA分子與PMA交聯(lián)的能力也就會(huì)越來越弱。相關(guān)研究結(jié)合PMA和EMA定量PCR，對(duì)厭氧發(fā)酵污泥中死菌、活菌細(xì)胞數(shù)的分析過程中，借助EMA、PMA，對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行了處理，不過洗脫罐污泥的外觀是深黑色的，這就使光線難以透過液體，曝光過程得到阻礙，也就對(duì)EMA、PMA與DNA的交聯(lián)產(chǎn)生了影響，為此，樣品中死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，無法通過EMA、PMA進(jìn)行抑制。

3 討論

通過PCR與PMA的結(jié)合，可以對(duì)異丙醇處理、檢測(cè)熱處理致細(xì)菌細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞死亡進(jìn)行選擇，對(duì)于樣品中的PMA而言，其質(zhì)量濃度＞3μg/ml時(shí)，曝光時(shí)間就會(huì)超過3 min，濁度小于10 NTU時(shí)，對(duì)于死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，PMA處理就會(huì)起到較好的抑制作用。PMA質(zhì)量濃度＞50μg/ml時(shí)，活細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增就會(huì)受到一定的影響，濁度＞100 NTU時(shí)，PMA的抑制作用就會(huì)失去效果。另外，在濁度對(duì)PMA光照交聯(lián)的影響中，運(yùn)用PMA與EMA結(jié)合的方法，進(jìn)行厭氧發(fā)酵污泥中死菌和活菌細(xì)胞數(shù)量的分析中，得知即使通過PMA或EMA的處理，但由于洗脫罐污泥對(duì)光線的阻擋，時(shí)曝光過程中PMA或EMA與DNA的交聯(lián)受到了限制，使樣品中死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增無法得到抑制。同時(shí)，由于EMA細(xì)胞毒性作用的影響，也就限制了EMA的有效應(yīng)用，但通過無毒性的PMA與PCR相結(jié)合，其應(yīng)用過程則更加安全適用。

[1]仝鐵錚,吳舒旭,施漢昌,等.基于PMA-定量PCR選擇性檢測(cè)技術(shù)的病原菌消毒特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(4):252.

[2]胡秀華,施漢昌,李 丹,等.水中輪狀病毒實(shí)時(shí)定量PCR外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(2):111.

[3]司文會(huì),訾言勤,屠一鋒.吖啶黃反應(yīng)光度法測(cè)定脫氧核糖核酸含量的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(2):412.

[4]李曉巖,劉啟才,彭 燕.腺病毒氣溶膠的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和綠色熒光蛋白活細(xì)胞檢測(cè)[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(5):785.