膠質芽孢桿菌液體發(fā)酵產孢培養(yǎng)基的優(yōu)化

王金玲 ， 趙鳳艷， 呂長山， 張洪超，3

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業(yè)大學 應用技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）又名膠凍樣芽孢桿菌，國內通常稱之為硅酸鹽細菌[1]，是一種多功能菌。

農業(yè)上，膠質芽孢桿菌具有解鉀、溶磷作用以及易形成根系優(yōu)勢種特性[2-3]，是目前我國微生物肥料產品中較為重要的一種。工業(yè)方面，膠質芽孢桿菌在無氮培養(yǎng)基或較大的C/N培養(yǎng)基中易產生顯著的胞外多糖莢膜，利用這種多糖的絮凝作用生產優(yōu)勢明顯的微生物絮凝劑前景廣闊[4-5]。冶金工業(yè)上，膠質芽孢桿菌可應用于細菌淋濾和改進某些礦物材料的特性[6]，尤其對低品位礦物的開發(fā)以及回收利用某些有用金屬具有良好的前景。養(yǎng)殖業(yè)方面，膠質芽孢桿菌生長過程產生的蛋白質、有機酸等，可用作飼料補充物，提高飼料的價值[7]。因此提高膠質芽孢桿菌的活菌或芽孢數量與質量具有重要的現實應用意義。

作者在培養(yǎng)基單因素篩選基礎上，選用二次回歸正交旋轉組合設計，考察了培養(yǎng)基組成對發(fā)酵結果的影響，以期更大程度上提高芽孢產量，為膠質芽孢桿菌的廣泛應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）CGMCC 1.0910，購自中國普通微生物菌種中心，經紫外誘變處理，作者所在實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:亞歷氏硅酸鹽細菌培養(yǎng)基，蔗糖 5 g；磷酸氫二鈉 2 g；七水硫酸鎂 0.5 g；氯化鐵 0.005 g；碳酸鈣 0.1 g；土壤礦物，取耕層土加入體積分數20%鹽酸（耕層土與鹽酸的質量體積比為1 g∶10 mL）煮沸30 min，蒸餾水洗至無氯離子，過 100 目篩[8]，1.0 g；瓊脂，30 g；蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:蔗糖 10 g；磷酸氫二鉀 0.5 g；七水硫酸鎂 0.5 g；碳酸鈣 1 g；蒸餾水 1 000 mL；pH 7.5。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖20 g；復合氮源2.5 g；磷酸氫二鉀1 g；七水硫酸鎂1 g；碳酸鈣5 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0～7.5。 其中，復合氮源質量比為硫酸銨:酵母浸膏粉=3∶1。

1.1.3 試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、硫酸銨、硫酸錳、磷酸氫二鈉、碳酸鈣、氫氧化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鐵為分析純試劑，天津天力化學試劑有限公司；麥芽糖、牛肉膏（氮質量分數13%）、蛋白胨（氮質量分數14.5%）、胰蛋白胨（氮質量分數12.5%）、酵母膏（氮質量分數7%）、干酪素（氮質量分數13.5%）、酵母浸膏粉（氮質量分數7.2%）、玉米漿粉（氮質量分數7.2%）、瓊脂:北京奧博星生物技術有限責任公司產品。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠產品；ZD-85恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司產品；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠產品；DH-6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱:天津市泰斯特儀器有限公司產品；XW-80A旋渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品；XB-K-25血細胞計數板:上海求精生化試劑儀器有限公司產品；XSZ-4G雙目顯微鏡:北京聯合科儀科技有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法 菌種活化:將保存的菌種轉接至斜面培養(yǎng)基，32℃活化24 h。

種子搖瓶培養(yǎng):用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥，接入裝有種子培養(yǎng)基35 mL的250 mL三角瓶中，32℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)2 0h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL，36℃，250 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h。

1.3.2 分析方法 芽孢計數法:試驗過程中因素與組合的優(yōu)劣比較采用血球計數板計數法[9]，計數前將菌液在80℃水浴槽中熱處理15 min。

1.3.3 試驗設計

1）單因素試驗 單因素選擇如下:碳源（20 g/dL的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇），碳源濃度（5、10、15、20、25、30、35 g/dL），有機氮源（酵母膏、酵母浸膏粉、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素和玉米漿粉，采用有機氮源與硫酸銨復合氮源），復合氮源質量濃度（復合氮源水平0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、3.75、4.375 g/dL，有機氮源與硫酸銨質量比為 1∶3）， 無機鹽 （0.1 g/dL，K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、CuCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4） 及無機鹽質量濃度[10-11]。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件:除單因素為變量外，其余采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，每個試驗3次重復。

2）二次回歸正交旋轉組合設計 根據單因素試驗結果組合培養(yǎng)基組分，進行二次回歸正交旋轉組合設計。

3）驗證試驗 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成進行驗證試驗，發(fā)酵工藝參數按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。驗證試驗3次重復。

1.3.4 數據處理方法 試驗中圖表繪制采用M icrosoft Excel處理；二次回歸正交旋轉組合設計與結果分析采用Design Expert 7.0及SAS 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素優(yōu)化試驗

2.1.1 碳源的篩選 碳源的篩選試驗結果如圖1所示，N為芽孢數量。由圖可知，6種碳源對芽孢產量的影響先后順序為乳糖＞甘露醇＞可溶性淀粉＞麥芽糖＞蔗糖＞葡萄糖，乳糖明顯優(yōu)于其他碳源，甘露醇次之。這是因為不同碳源對微生物發(fā)酵的影響與碳源結構和發(fā)酵過程中的中間代謝產物 （如酶等）有關，能夠為菌體快速吸收利用且存在有利于芽孢轉換的碳源有利于活菌數與芽孢產量的提高。

2.1.2 碳源質量濃度的篩選 通過單因素7水平試驗對乳糖濃度進行篩選，結果如圖2所示。由圖可以看出，當乳糖質量濃度為5～20 g/dL時，芽孢產量呈現上升趨勢；之后隨著添加量的繼續(xù)增大，芽孢量略有下降。曲線初始變化趨勢明顯，這與碳源對膠質芽孢桿菌的作用方式有關，增加碳源利于菌體的快速繁殖；但超過一定濃度后則對發(fā)酵液的理化性質產生不良影響，導致芽孢量有所下降。試驗中選擇10～30 g/dL作為進一步優(yōu)化的試驗范圍。

圖1 不同碳源對芽孢產量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on spore yield

圖2 碳源質量濃度對芽孢產量的影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on spore yield

2.1.3 氮源的篩選 試驗中采用有機氮與硫酸銨混合的復合氮源[10-11]，有機氮源的篩選中以蛋白胨添加0.625 g/dL和硫酸銨添加1.875 g/dL為參照；其他有機氮源含氮量調整到與蛋白胨相同，添加的硫酸銨含量不變。結果表明（圖3），膠質芽孢桿菌芽孢產量最大的為酵母浸膏粉，其次為蛋白胨；兩者生成芽孢量分別為3.22×109cfu/mL和3.05×109cfu/mL，干酪素對產孢的影響也較好；但在相同含氮量的情況下，酵母浸膏粉的添加量為蛋白胨的2倍，而增加的芽孢產量為5.6%。

以硫酸銨作為固定無機氮源有利于菌體的快速吸收，而采用有機氮源則可以提供緩釋氮元素，其中還含有一些利于菌體生長與芽孢轉換的生長因子和微量元素。因此從芽孢產量及經濟方面考慮，試驗中選擇微生物發(fā)酵中常用的蛋白胨為最佳有機氮源。

圖3 不同氮源對芽孢產量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on spore yield

2.1.4 氮源質量濃度的篩選 以硫酸銨為無機氮源，蛋白胨為有機氮源，有機氮質量∶無機氮質量=1∶3進行復合氮源濃度的篩選試驗，結果見圖4。

由圖可知，芽孢產量隨復合氮源質量濃度的增加呈現先急速上升后緩慢下降的趨勢，其中曲線峰值出現點為2.5 g/dL。

無機氮與有機氮的搭配有利于滿足發(fā)酵不同階段的需求，既有利于菌體增殖又有利于芽孢的生成，根據試驗設計的需求，選擇的氮源進一步優(yōu)化范圍為 1.25～3.75 g/dL。

圖4 復合氮源質量濃度對芽孢產量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on spore yield

2.1.5 無機鹽的篩選 無機鹽的篩選試驗結果如圖5所示。由圖可見，在試驗濃度條件下，除Mn2＋可以較明顯地促進產孢外，其他離子對促進產孢均無效果，其中 Mg2＋、K+具有輕微抑制作用，而 Zn2＋、Cu2＋、Al3＋、Fe2＋、Fe3＋則表現出明顯的抑制作用， 這可能與金屬離子的作用方式和膠質芽孢桿菌的生長習性有關。

2.1.6 硫酸錳質量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗結果顯示，硫酸錳具有促進芽孢生成的作用，試驗中設計了單因素7水平篩選試驗，結果見圖6。

由圖可見，在 0.05～0.10 g/dL 和 0.30～0.35 g/dL范圍內，芽孢量變化趨勢均較平緩，曲線中芽孢量較高且曲線變化幅度較大的硫酸錳質量濃度范圍是0.10～0.30 g/dL，此范圍可作為下一步優(yōu)化試驗的考查范圍。

圖5 不同金屬離子對芽孢產量的影響Fig.5 Effect of different metallic ions on spore yield

圖6 硫酸錳質量濃度對芽孢產量的影響Fig.6 Effect of MnSO4concentration on spore yield

2.1.7 磷酸氫二鉀質量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗結果顯示鉀離子對產孢有輕微抑制作用，但是多數研究者的培養(yǎng)基配方中均加入了磷酸氫二鉀[9，12]，為了驗證鉀離子對產芽孢的作用，進行磷酸氫二鉀質量濃度的篩選試驗，結果如下圖7所示。

2.1.5 中選擇的質量濃度為0.1 g/dL，當磷酸氫二鉀質量濃度從0.1 g/dL增加時，芽孢產量迅速增加（部分數據未顯示），到1 g/dL時，lg N達到9.04，在1～2 g/dL的范圍內，變化趨勢平緩，之后有所下降，說明在金屬離子篩選試驗中，鉀鹽濃度偏低，造成結果不同。由于磷酸氫二鉀濃度在1～2 g/dL范圍內對產孢影響不大，所以后續(xù)試驗將其固定在最佳水平，即1.5 g/dL。

圖7 磷酸氫二鉀質量濃度對芽孢產量的影響Fig.7 Effect of K2HPO4concentration on spore yield

2.1.8 硫酸鎂質量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗結果顯示鎂離子對芽孢產量有輕微抑制作用，與鉀離子相似，對硫酸鎂的濃度篩選試驗見圖8所示。由圖可見，隨鎂離子質量濃度增加，芽孢產量先增加后下降；硫酸鎂質量濃度在1.2 g/dL時，芽孢產量最大。由于硫酸鎂濃度在0.9～1.5 g/dL范圍內對芽孢產量影響幅度不大，所以后續(xù)試驗將其固定在最佳值水平，即1.2 g/dL。

圖8 硫酸鎂濃度對芽孢產量的影響Fig.8 Effect of MgSO4·7H2O concentration on spore yield

2.2 二次回歸正交旋轉組合設計優(yōu)化培養(yǎng)基組成

2.2.1 二次回歸正交旋轉組合設計及結果 碳源與氮源及其質量濃度對發(fā)酵具有重要的影響，第一階段的單因素試驗已篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為乳糖，有機氮源為蛋白胨；金屬鹽中硫酸錳對發(fā)酵產芽孢具有明顯影響，選擇碳源質量濃度、氮源質量濃度和硫酸錳質量濃度進行二次回歸正交旋轉組合設計優(yōu)化，其他因素固定在最佳值水平；因子及水平設計見表1，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 二次回歸正交旋轉組合設計因素及水平表Table1 Factorsand levelsofquadratic regression orthogonal rotation composite design

表2 二次回歸正交旋轉組合設計及結果Table2 Resultsofquadratic regression orthogonal rotation composite design

表3 試驗結果方差分析Table 3 ANOVA for the results

為檢驗回歸方程的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F2=回歸均方/剩余均方的程序進行檢驗。由表3可知，失擬項的F值為1.62，P=0.26＞0.05，說明失擬檢驗不顯著，所采用的回歸模型適應于本研究中培養(yǎng)基組成的分析；二次回歸模型的F值為71.08，P＜0.000 1， 說明模型的擬合極顯著；R2=回歸平方和/總平方和=0.979 9，說明所建立的回歸方程能在97.99%水平上很好地表達碳源質量濃度、氮源質量濃度及硫酸錳質量濃度3個因素之間的關系。

2.2.2 主效應分析 回歸方程中因素前面系數的絕對值大小決定了各因素對試驗結果的影響程度，經比較有:X3＞X1＞X2，即考察的 3 種因素對膠質芽孢桿菌芽孢產量的影響大小為硫酸錳質量濃度＞碳源質量濃度＞復合氮源質量濃度。

2.2.3 最優(yōu)培養(yǎng)基與產量預測 針對試驗數據的回歸方程，利用SAS9.0軟件進行試驗方案的預測分析，得到表4的培養(yǎng)基及芽孢量預測值。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基預測值方案Table 4 Optimization solution in the experiment

根據優(yōu)化模型可知，在1 L培養(yǎng)基中，當乳糖21.57 g，復合氮源 2.60 g，硫酸錳 0.21 g，磷酸氫二鉀1.5 g，硫酸鎂1.2 g時，膠質芽孢桿菌在搖瓶培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，芽孢產量預測達到3.52×109cfu/mL。

用優(yōu)化培養(yǎng)基進行驗證試驗，結果表明，血球計數板計數所得膠質芽孢桿菌芽孢產量為3.44×109cfu/mL（n=3），實際值/模型最佳值=0.977，說明最佳模型可靠，得到的培養(yǎng)基可被之后發(fā)酵工藝參數的優(yōu)化試驗選用。

3 結語

1）膠質芽孢桿菌發(fā)酵的研究，目前主要集中在如何提高產菌量或者芽孢數量方面，以利于后期的工農業(yè)生產應用。在膠質芽孢桿菌的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件均對最終有效活菌數產生較大的影響。

胡秀芳等[13]對一株離子束誘變的膠質芽孢桿菌進行了培養(yǎng)條件研究，結果表明，碳源對生物量和芽孢形成的影響最大，其次是氮源，磷和鉀的影響較?。话l(fā)酵培養(yǎng)基的理想配方（質量分數）為:2%淀粉 、0.4% 酵 母 、0.1%K2HPO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.5%CaCO3，pH 7.5；種子菌經二級擴大培養(yǎng)后，芽孢量可達到9.8×108cfu/mL。劉五星[10]等人通過正交試驗獲得膠質芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基組成為 （%）:葡萄糖 1， 硫酸銨 0.15， 酵母膏 0.01，KCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.01，NaH2PO40.01，CaCO30.1，此條件下活菌數可達6.5億/mL。李東華等[14]的研究結果為糖蜜 3.2%，復合氮源（m（硫酸銨）∶m（豆粕）=2∶1）0.4%，pH 8.0，為最佳培養(yǎng)基條件，響應面法預測的最大理論數值為3.03×108cfu/mL，實際值為3.09×108cfu/mL。

試驗中獲得的膠質芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基組成為1 L培養(yǎng)基中，乳糖21.57 g，復合氮源2.6 g，硫酸錳 0.21 g，磷酸氫二鉀 1.5 g，硫酸鎂1.2 g，pH 7.0～7.5。以血球計數板計數，芽孢產量達到3.44×109cfu/mL。本研究結果不同于其他研究者的結果，可能是菌株營養(yǎng)型不同，或者菌株生長的環(huán)境不同等原因造成的。

試驗中對常見的碳源、有機氮源和無機鹽進行了篩選，結果表明不同結構及不同聚合度的碳源對微生物的菌體密度及芽孢轉化具有一定的影響。采用不同有機氮源的培養(yǎng)基中芽孢形成量也有差別，干酪素作為氮源形成的芽孢量也較多，可能與其中氮素的存在形式和營養(yǎng)因子[15]有關，具體作用機制還有待研究。此外，復合氮源的配比上試驗選擇為固定的有機氮源與無機氮源質量比為1∶3，這種組合對不同的有機氮而言也會有一些影響。無機鹽中硫酸錳對于芽孢的形成具有明顯促進作用，這在其他研究者的結果中未體現，錳離子對于芽孢的促進作用機理，還需要進一步研究。

試驗采用二次回歸正交旋轉組合設計優(yōu)化培養(yǎng)基組成，得到了有效的回歸方程和預測方案，這表明此設計方案對預測試驗結果具有一定的可行性。二次回歸正交旋轉組合試驗為面體反應，因此它與一些復雜的響應面[16]等方法的效果具有一定的可比性，而試驗過程則得到了簡化。

2）膠質芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基組成為1 000 mL培養(yǎng)基中，乳糖21.57 g，復合氮源2.6 g，硫酸錳0.21 g，磷酸氫二鉀 1.5 g，七水硫酸鎂 1.2 g，pH 7.0～7.5。以血球計數板計數，芽孢產量達到3.44×109cfu/mL。

通過分階段的優(yōu)化試驗，即單因素試驗，二次回歸正交旋轉組合設計及驗證試驗，得到了膠質芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成，并預測芽孢量，與驗證試驗實際值相符，說明模型的可靠性。所得最佳培養(yǎng)基可以為工農業(yè)生產膠質芽孢桿菌提供參考數據。

[1]劉五星，楊啟銀，徐旭士，等.硅酸鹽細菌肥料的研究進展[J].天津農業(yè)科學，2003，9（4）:39-42.LIU Wu-xing，YANG Qi-yin，XU Xu-shi，et al.Research progess of silicate bacteria fertilizer[J].Tianjin Agricultural Science，2003，9（4）:39-42.（in Chinese）

[2]趙艷，張曉波，郭偉.不同土壤膠質芽孢桿菌生理生化特征及其解鉀活性[J].生態(tài)環(huán)境學報，2009，18（6）:2283-2286.ZHAO Yan，ZHANG Xiao-bo，GUO Wei.Physiological and biochemical characteristics and capacities of potassium-releasing of Bacillus mucilaginous screened from different soils[J].Ecology and Environmental Sciences，2009，18 （6）:2283-2286. （in Chinese）

[3]BASAK B B，BISWAS D R.Co-inoculation of potassium solubilizing and nitrogen fixing bacteria on solubilization of waste mica and their effect on growth promotion and nutrient acquisition by a forage crop[J].Biol Fertil Soils，2010，46:641-648.

[4]曾曉希，劉學端，湯建新，等.一株絮凝劑產生菌的16srRNA鑒定和絮凝性能研究[J].生命科學儀器，2008，6（9）:30-33.ZENG Xiao-xi，LIU Xue-duan，TANG Jian-xin，et al.Identification and characteristics of bioflocculant of a bioflocculantproduced strain[J].Life Science Instruments，2008，6（9）:30-33.（in Chinese）

[5]LIAN B，CHEN Y，ZHAO J，et al.Microbial flocculation by Bacillus mucilaginous:Applications and mechanisms[J].Bioresource Technology，2008，99:4825-4831.

[6]朱云，曹維政，魯安懷，等.膠質芽孢桿菌-蒙脫石相互作用實驗研究[J].巖石礦物學雜志.2011，30（1）:121-126.ZHU Yun，CAO Wei-zheng，LU An-huai，et al.A study of the interaction between montmorillonite and a strain of Bacillus mucilaginous[J].Acta Petrologica et Mineralogica，2011，30（1）:121-126.（in Chinese）

[7]WECKE C，VINOGRADOV JJ，CHOCHRIN，SN，et al.Protein quality of bacterial biomass （Bacillus mucilaginous） and some results of its utilization in feeding domestic animals [J].Wissenschaftliche Zeitschrift-Karl-Marx-Universitat:Mathematisch-Naturwissen-schaftliche Reihe，1983，32（6）:601-605.

[8]劉五星.膠質芽孢桿菌解鉀作用與發(fā)酵條件研究及在煙草上的應用[D].南京:南京師范大學，2003.

[9]趙志浩，徐銀榮，邱龍.膠質芽孢桿菌的發(fā)酵工藝與田間應用[J].湖南農業(yè)科學，2004，5:34-37.ZHAO Zhi-hao，XU Yin-rong，QIU Long.Study on the fermented craft of Bacillus mucilaginous and its application[J].Hunan Agricultural Sciences，2004，5:34-37.

[10]劉五星，徐旭士，楊啟銀，等.膠質芽孢桿菌發(fā)酵條件研究[J].南昌大學學報:理科版，2002，26（3）:299-302.LIU Wu-xing，XU Xu-shi，YANG Qi-yin，et al.Study on fermentation of Bacillus mucilaginous[J].Journal of Nanchang University，2002，26（3）:299-302.（in Chinese）

[11]王雪，袁曉凡，趙兵，等.膠質芽孢桿菌培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的研究進展[J].過程工程學報，2010，10（2）:399-415.WANG Xue，YUAN Xiao-fan，ZHAO Bing，et al.Research progress in culture conditions and fermentation technology of Bacillus mucilaginous[J].The Chinese Journal of Process Engineering，2010，10（2）:399-415.（in Chinese）

[12]王雪，袁曉凡，趙兵，等.膠質芽孢桿菌PM13菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].過程工程學報，2010，10（3）:582-587.WANG Xue，YUAN Xiao-fan，ZHAO Bing，et al.Optimization of culture medium for growth of B.mucilaginous PM13 Strain[J].The Chinese Journal of Process Engineering，2010，10（3）:582-587.（in Chinese）

[13]胡秀芳，應飛祥，陳集雙.膠質芽孢桿菌突變株021120的培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國生物工程雜志，2007，27（9）:58-62.HU Xiu-fang，YING Fei-xiang，CHEN Ji-shuang.Optimization of fermentation conditions of Bacillus mucilaginous mutant 021120[J].China Biotechnology，2007，27（9）:58-62.（in Chinese）

[14]李東華，楊博.響應面法優(yōu)化膠質芽孢桿菌GM1增殖發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品工業(yè)科技，2012，33（22）:206-209.LI Dong-hua，YANG Bo.Application of response surface methodology to optimize the spore production of B.mucilaginous GM1[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（22）:206-209.（in Chinese）

[15]ARASARATNAM V，SENTHURAN A，BALASUBRAMANIAM K.Supplementation of whey with glucose and different nitrogen sources for lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii[J].Enzyme Microb Technol，1996，19（7）:482-486.

[16]HE J，ZHEN QW，QIU N，et al.Medium optimization for the production of a novel bioflocculant from Halomonas sp.V3a’ using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2009，100（23）:5922-5927.