熱泵干燥過程荔枝果肉多酚組成及抗氧化活性變化

唐道邦， 楊韋杰， 肖更生， 程麗娜， 徐玉娟， 林 羨

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）

氧化應(yīng)激與生物體癌癥、炎癥、神經(jīng)性衰退和心腦血管疾病等諸多病癥密切相關(guān)[1-2]，并且是導(dǎo)致衰老的重要原因，醫(yī)學(xué)上常利用食源或藥源的抗氧化劑減輕或抑制氧化損傷來預(yù)防和治療這些疾病。

多酚是一類廣泛分布于植物體中的化合物，包括黃酮類、單寧類和酚酸[3-4]；多酚具有抗氧化、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病和癌癥等多種生物活性[5-6]。多酚類物質(zhì)作為果蔬天然生物活性的重要物質(zhì)，目前一些發(fā)達(dá)國家已將果蔬的總酚含量和抗氧化能力作為評價果蔬品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。但天然多酚類化合物很不穩(wěn)定，加熱和有氧條件下容易發(fā)生氧化反應(yīng)，改變自身結(jié)構(gòu)，甚至喪失抗氧化活性[7]。

荔枝中含有大量酚類物質(zhì)，目前關(guān)于荔枝酚類物質(zhì)的研究報道主要集中于荔枝多酚的提取、純化、測定，采后的保鮮過程中多酚的氧化等，而荔枝干制過程中多酚的變化規(guī)律較少研究。荔枝干是傳統(tǒng)滋補(bǔ)食品之一，干制作為荔枝加工的主要形式，占加工總量的80%以上[8]。荔枝在常溫下就極不耐儲藏[9]，干制加工過程中，荔枝長時間暴露于高溫和有氧條件下，其果肉酚類物質(zhì)更易氧化。熱泵干燥是一種新型節(jié)能干燥方法，根據(jù)熱泵干燥溫度高低又分為低溫?zé)岜酶稍?（18～35℃）、中溫?zé)岜酶稍铮?5～50℃）、高溫?zé)岜酶稍铮?0～70℃），高溫?zé)岜酶稍锊捎肦134a型冷媒，適合需較高溫度干燥的農(nóng)產(chǎn)品加工處理。將新鮮荔枝整果進(jìn)行高溫?zé)岜酶稍?，分析干燥過程中荔枝果肉酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、組成、存在形式及抗氧化能力的變化，為高品質(zhì)荔枝果干加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料 荔枝:品種“懷枝”，取自廣東茂名某商業(yè)果園，成熟度8～9成（果皮85%轉(zhuǎn)紅，果柄部位仍帶有青色）。采摘后冷藏于泡沫箱，嚴(yán)格挑選大小、形狀、顏色均一的果實(shí)用于干燥試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑及溶液配制 TPTZ（Fe3+-三吡啶三吖嗪）: 日本 Alfa aesar 公司產(chǎn)品；Trolox、AAPH、Fluorescein、福林酚試劑、沒食子酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、四甲基鄰苯二酚、香豆素、蘆丁、槲皮素:美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸、乙腈:色譜級，美國Fisher公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制:準(zhǔn)確稱取沒食子酸、綠原酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、四甲基鄰苯二酚、香豆素、蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各0.005 0 g用甲醇溶解定容至5 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 GHRH-20型高溫?zé)岜酶稍锵到y(tǒng):廣東省農(nóng)業(yè)機(jī)械研究所提供；ALC-210.4電子分析天平:德國ACCULAB公司產(chǎn)品；MJ-25PM01B組織勻漿機(jī):廣東美的電器制造有限公司產(chǎn)品；UV-1800紫外可見分光光度計:日本島津公司產(chǎn)品；TD6臺式離心機(jī):長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本EYELA公司提供；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；HX-1050恒溫循環(huán)器:北京德天佑科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Infinite M1000全波長多功能酶標(biāo)儀:瑞士TECAN公司產(chǎn)品；Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 干燥工藝流程 鮮果→挑選→剪枝→清洗→熱燙→干燥→成品

1.2.2 熱泵干燥試驗(yàn)方法 干燥溫度60℃，風(fēng)速1.0 m/s。干燥前，機(jī)器預(yù)熱30 min，達(dá)到穩(wěn)定溫度后稱?。?0±0.2） kg鮮荔枝，按 5.0 kg/m3裝載量放入干燥室。干燥過程中每干燥12 h停止加熱讓果品回軟3 h，然后重復(fù)加熱與回軟直至含水量達(dá)到要求，回軟時間不計入整體干燥時間內(nèi)。

1.2.3 荔枝果肉游離酚提取 稱取20 g荔枝樣品加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為 80%丙酮（預(yù)冷），組織勻漿機(jī)在冰浴條件下勻漿3 min，常溫振蕩提取1 h之后5 000 r/min離心10 min，保留上清液，沉淀物再次加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%丙酮重復(fù)上述步驟提取一次。合并兩次離心得到的上清液，45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)相無殘留，殘余物用蒸餾水定容至50 mL。分裝后凍存于-20℃冰箱[9]。重復(fù)3次作為平行。

1.2.4 結(jié)合酚提取 1.2.3提取所得的固體殘余物加入25 mL 4 mol/L的NaOH溶液，充入氮?dú)夂竺芊?，常溫下震? h。所得的水解液用4 mol/L HCl調(diào)pH至2，用100 mL乙酸乙酯萃取6次。合并有機(jī)相萃取液，在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)相無殘留，殘余物用蒸餾水定容至10 mL。分裝后凍存于-20℃冰箱[11]，重復(fù)3次作為平行。

1.2.5 總酚測定 將制備的多酚提取液用蒸餾水稀釋至合適的濃度，取0.1 mL稀釋液和6 mL蒸餾水到10 mL容量瓶中，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑混勻后立即漩渦震蕩搖勻30 s左右，充分接觸1～8 min加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3并定容至10 mL。25℃暗室靜置2 h后，用紫外分光光度計測定其在760 nm波長的吸光值[12]?？偡淤|(zhì)量分?jǐn)?shù)以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)計。制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.009x+0.0346，R2=0.999 4。

1.2.6 ORAC抗氧化能力測定 氧化自由基吸收能力（Oxygen Radical Absorption Capacity，ORAC）反應(yīng)在75 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）環(huán)境中和黑色96孔板上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前將酚提取液用緩沖液稀釋到合適的濃度。96孔板相應(yīng)槽中加入20 μL的酚提取物，緩沖溶液或 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液（6.25～50 μmol/L）和 200 μL 的 fluoroscein 溶液（0.96 μmol/L）后 37℃孵育20 min，此后每個槽加入20 μL 119 mmol/L的AAPH，將微孔板置于酶標(biāo)儀中，在37℃下以激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm進(jìn)行連續(xù)測定，每5 min測定一次各孔熒光強(qiáng)度，測定35個循環(huán)[13]。ORAC值以μmol/g表示。

1.2.7 酚組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

1）樣品前處理 將酚類物質(zhì)提取液用乙酸乙酯萃取3次（體積比1∶1），收集有機(jī)相萃取液旋蒸至有機(jī)相無殘留，用甲醇定容到10 mL，取1 mL過0.22 μm 濾膜，-20 ℃保存待測[14]。

堅(jiān)持《論語》積累，在閱讀、寫作乃至對傳統(tǒng)文化的敬畏虔誠的態(tài)度上及由此帶來的做人、做事、做學(xué)問方面全面提高、開枝散葉，真是令人嘆為觀止。

2）色譜條件 經(jīng)前處理的樣品，在儀器最佳測定條件下使用配有VWD紫外檢測器的美國Agilent 1200 LC高效液相色譜儀，色譜柱為ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A:乙腈，B:體積分?jǐn)?shù)0.4%冰醋酸；流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長280 nm；梯度洗脫程序:流動相B在0～40 min時，由95%降至 75%；在 40～45 min時，由75%降至65%；在45～50 min時，由65%降至50%；進(jìn)樣量 20 μL[15]。

3）定量分析 將配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇梯度稀釋，在上述色譜條件下分析不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 7以上，線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1；并用標(biāo)準(zhǔn)品做回收實(shí)驗(yàn)，回收率為0.95以上，能滿足定量分析的要求。

表1 酚類化合物單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of phenolic compounds monomer

1.2.8 統(tǒng)計分析 實(shí)驗(yàn)經(jīng)完全隨機(jī)取樣并設(shè)3個平行，每平行兩次測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式給出，所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0單因素方差分析和最小顯著性差異計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

荔枝高溫?zé)岜酶芍七^程中游離酚、結(jié)合酚和總酚的變化如圖1所示。結(jié)果顯示荔枝干制前后游離酚的含量極顯著下降（P＜0.01），由3.30 mg/g下降至1.12 mg/g，降低了66.03%。其中干燥12 h和24 h游離酚含量均極顯著降低 （P＜0.01），24 h后游離酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著變化（P＞0.05）；干制前后結(jié)合酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著降低（P＜0.01），由0.74 mg/g下降至0.19 mg/g，降低了74.74%，其中干燥12 h結(jié)合酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著降低 （P＜0.01），干燥24 h和48 h無顯著變化（P＞0.05），干燥 36 h和 60 h顯著降低（P＜0.05）； 干制前后總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低 （P＜0.01）， 由 4.04 mg/g下 降 至 1.31mg/g，降低 了67.63%，其中干燥12 h和24 h極顯著降低 （P＜0.01），此后無顯著變化（P＞0.05）。 結(jié)合酚占總酚的比率顯著降低（P＜0.05），由 18.31%降至 14.29%，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖1 荔枝高溫?zé)岜酶稍镞^程中酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.1 Changes in the contents of phenolics during HTHPD processing

2.2 酚類化合物組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

荔枝高溫?zé)岜酶稍锛庸で昂蠊鈫误w酚類化合物組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如表2所示，結(jié)果顯示游離酚中沒食子酸在鮮果中檢測到，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于檢測限，干燥后顯著上升（P＜0.05）；兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在干燥過程中顯著下降（P＜0.05）；香草酸、咖啡酸和表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升（P＜0.05）；四甲基鄰苯二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)下降，干制成品中未檢測到；蘆丁在鮮果中質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于檢測限，干燥后質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升（P＜0.05）。

結(jié)合酚中沒食子酸在鮮果中檢測到，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于檢測限，干燥過程中顯著上升（P＜0.05）；其中兒茶素、咖啡酸和表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)干燥后顯著上升（P＞0.05）；蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降（P＜0.05）；香草酸、四甲基鄰苯二酚未檢測到。

表2 荔枝高溫?zé)岜酶稍锴昂蠊鈫误w酚類化合物組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Composition and content of phenolics of litchi pulp after HTHPD processing

2.3 ORAC抗氧化能力的變化

整果干制過程中游離酚、結(jié)合酚、總酚的ORAC抗氧化能力變化如圖2所示。結(jié)果顯示干燥過程中游離酚ORAC抗氧化能力顯著降低，由86.36 μmol/g降至 27.11 μmol/g，下降了 68.60%，其中干燥 12 h和24 h極顯著降低（P＜0.01），干燥36 h無明顯變化 （P＞0.05）， 隨后的干燥時段均極顯著降低 （P＜0.01）。干燥過程中結(jié)合酚ORAC抗氧化能力顯著降低（P＜0.01），由 19.28 μmol/g 下降至 6.07 μmol/g，下降了68.48%，其中干燥前48 h ORAC抗氧化能力均極顯著降低（P＜0.01），60 h相比48 h抗氧化能力有所下降，但無顯著變化（P＞0.05）?？偡覱RAC抗氧化能力顯著降低（P＜0.01），由 105.64 μmol/g 降至35.12 μmol/g，下降了 68.58%；其中干燥前 48 h ORAC抗氧化能力顯著降低（P＜0.05），60 h相比48 h抗氧化能力下降，但無顯著變化（P＞0.05）。

圖2 荔枝高溫?zé)岜酶稍镞^程中果肉多酚ORAC抗氧化能力Fig.2 ORAC value of phenolic compounds of litchi pulp during HTHPD processing

圖3 干制過程中游離酚和結(jié)合酚的ORAC值所占百分比Fig.3 Percentage of ORAC value of free and bound fractions of phenolic compounds during HTHPD processing

2.4 總酚與抗氧化能力相關(guān)性分析

游離酚、結(jié)合酚ORAC抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果見圖 4（a）、（b），由圖可知酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力大小顯著相關(guān)，即酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，抗氧化能力越強(qiáng)。

圖4 酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力相關(guān)性分析Fig.4 Relationship between total antioxidant activity and phenolic contents

3 討論

比較干燥過程中荔枝果肉游離酚和結(jié)合酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)不論干燥前后荔枝果肉總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要以游離酚形式存在，結(jié)合酚占總酚含量比例為14.26%～20.74%。Sun[10]等研究發(fā)現(xiàn)酸莓、蘋果、草莓等很多水果，結(jié)合酚占總酚比例在10%以下，游離酚抗氧化能力在總抗氧化能力中占絕對優(yōu)勢。質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)由于荔枝果肉中結(jié)合酚占總酚比率較一般水果高，其抗氧化能力所占比重相對較大，如果單獨(dú)以游離酚含量和其抗氧化能力來評估荔枝相關(guān)指標(biāo)的活性水平，將會影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

干燥24 h后總酚及游離酚含量變化不明顯，可能是由于24 h作為干燥過程中酚類物質(zhì)變化的一個類似終結(jié)點(diǎn)，此后酚類物質(zhì)生理代謝微弱，酶已失活，故含量變化不明顯。結(jié)合酚的變化趨勢有所不同，可能是由于復(fù)雜的次生代謝使某些物質(zhì)生成或發(fā)生轉(zhuǎn)換。

干燥過程中，結(jié)合酚占總酚比例先顯著上升后下降，可能由于結(jié)合酚相對游離酚結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，不易被氧化；干燥初期游離酚發(fā)生聚合或氧化反應(yīng)而質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降，且游離酚會通過疏水鍵和氫鍵與果肉中的蛋白質(zhì)和糖類發(fā)生縮合反應(yīng)向結(jié)合酚轉(zhuǎn)化，引起干燥初期相應(yīng)比例上升；隨著干燥的進(jìn)行，果肉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，游離水?dāng)U散進(jìn)入空氣，導(dǎo)致疏水鍵和氫鍵的破壞，結(jié)合酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，相應(yīng)比例下降[15-16]。干燥過程中的相對高溫和氧氣環(huán)境，破壞荔枝果肉細(xì)胞的完整性，引起果肉組織內(nèi)氧化反應(yīng)的加劇，導(dǎo)致果肉類內(nèi)游離酚和結(jié)合酚的顯著下降并顯著影響多酚單體組成的變化。Zhang[13]在研究中均發(fā)現(xiàn)，荔枝果肉內(nèi)含有大量的沒食子酸、兒茶素、表兒茶素和蘆丁等化合物及其同分異構(gòu)體，作者通過標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證得到了類似的結(jié)果。結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的單體酚含量及組成的變化可能是由于隨著次生代謝的進(jìn)行，產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物是單體酚，或者其他物質(zhì)轉(zhuǎn)換成單體酚，或其中某些單體酚之間也可以相互轉(zhuǎn)換，例如表兒茶素與兒茶素之間的轉(zhuǎn)化。

荔枝干制過程中游離酚ORAC抗氧化能力占總抗氧化能力的比例維持73.2%以上，說明游離酚是荔枝果肉抗氧化能力的主要物質(zhì)。酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力大小顯著正相關(guān)，酚含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)[16-17]，作者得到了相同的結(jié)果。隨著干燥的進(jìn)行，結(jié)合酚占總酚比例呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，對應(yīng)的游離酚ORAC值所占百分比就呈現(xiàn)出先下降、后上升再保持不變的趨勢。雖然酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的具體變化趨勢與ORAC值的具體變化趨勢有所不同，這可能是由于隨著干燥時間的延長，荔枝果肉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，果肉中活性物質(zhì)的自由基反應(yīng)速率增加，某些抗氧化性強(qiáng)的單體酚與其他物質(zhì)反應(yīng)轉(zhuǎn)換成其他物質(zhì)，或是其他某些物質(zhì)反應(yīng)生成一些抗氧化性不強(qiáng)的單體酚，因而存在酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不顯著，但是對應(yīng)點(diǎn)的ORAC值顯著降低。

4 結(jié)語

試驗(yàn)研究分析以荔枝高溫?zé)岜酶芍七^程中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、組成、存在形式及其抗氧化能力的變化，結(jié)果表明:（1）荔枝高溫?zé)岜酶稍镞^程中，游離酚、結(jié)合酚和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著干燥的進(jìn)行顯著降低 （P<0.01），結(jié)合酚占總酚的比率顯著降低 （P<0.01）。（2）干燥過程中，游離酚、結(jié)合酚和總酚的ORAC抗氧化能力顯著降低（P<0.01），游離酚對抗氧化能力的貢獻(xiàn)最大。（3）經(jīng)高溫?zé)岜酶稍锖罄笾庥坞x酚組成中沒食子酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素和蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升；兒茶素顯著下降；四甲基鄰苯二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)下降，干制成品中未檢測到；結(jié)合酚中沒食子酸、兒茶素、咖啡酸和表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升（P<0.05）；蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降；香草酸、四甲基鄰苯二酚未檢測到。（4）由酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果可知，抗氧化能力和酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多少呈顯著正相關(guān)，酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)論:荔枝干制后果肉多酚組成和抗氧化活性均發(fā)生變化。

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