無(wú)溶劑體系酶催化酯化反應(yīng)合成1，3-甘油二酯的研究

魯 珊， 黃健花， 王興國(guó)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

甘二酯，也稱為脂肪酸甘油二酯（DAG），是由丙三醇（甘油）與兩個(gè)脂肪酸酯化得到的產(chǎn)物，按空間異構(gòu)分為 1，3-甘二酯（1，3-DAG）和 1，2-甘二酯（1，2-DAG）。其中，天然食用油脂中的甘二酯以1，3-DAG為主，占甘二酯總量的70%左右。1，3-DAG具有很好的乳化性能，可作為乳化劑廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)；另一方面還具有許多生理功能，可用于預(yù)防與治療高脂血癥及與高脂血癥密切相關(guān)的心腦血管疾病，近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注[1-3]。

目前合成1，3-DAG主要有化學(xué)法和酶法?；瘜W(xué)法得到高純度的產(chǎn)品比較困難，往往需要多步驟的反應(yīng)以及繁瑣的純化操作[4]。酶法反應(yīng)條件溫和，且由于酶的選擇性，較易得到高純度的1，3-DAG。角田昭等人研究了在脫水條件下利用堿性脂肪酶進(jìn)行的酯化反應(yīng)，反應(yīng)48h酯化率達(dá)到96%，甘油二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%[5]。Masakatsu[6]等人利用固定化脂肪酶作為催化劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，酯化率能達(dá)到86%左右，甘油二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)65%，但是反應(yīng)是使用的是非特異性脂肪酶，所以得到的DAG是1，3-DAG和1，2-DAG的混合物。邱壽寬等人用Lipozyme RM IM做催化劑，以大豆和甘油為底物，在最適條件下，甘二酯得率為51.7%。

作者選用特異性酶Lipozyme RM IM做催化劑，以脂肪酸、甘油為原料直接酯化生成1，3-DAG，不僅反應(yīng)方便，可一步完成，且產(chǎn)物純度較高，反應(yīng)時(shí)間較短，為進(jìn)一步放大和商業(yè)化提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

Lipozyme RM IM（物理吸附大孔陰離子交換樹(shù)脂）:諾維信生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甘油（AR級(jí)）:國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；油酸（AR級(jí)）:國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

Re-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；Waters 1525高效液相色譜:美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；TGL-16B離心機(jī):上海安亭科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酯化方法 取16.14 g油酸，然后將油酸與甘油按一定摩爾比混合，于一定溫度、80 r/min攪拌均勻，添加一定量的固定化酶于真空反應(yīng)器（真空度0.07 MPa）或常壓反應(yīng)器反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)過(guò)程中，按一定時(shí)間間隔取樣分析反應(yīng)物組成。

1.2.2 酸值的測(cè)定 按GBT 5530-2005進(jìn)行。

1.2.3 酯化率的計(jì)算

酯化率（%）=[（反應(yīng)起始酸價(jià)-反應(yīng)物的酸價(jià)）/反應(yīng)起始酸價(jià)]×100%

1.2.4 甘油酯組成分析 酯化產(chǎn)物用正己烷萃取，加少量水離心收集油相，吹氮?dú)獬軇琀PLC分析。分析條件:Waters Spherisorb Silica色譜柱（2.0 mm×250 mm）；流動(dòng)相 A:正己烷-異丙醇（體積比99∶1）；流動(dòng)相 B:正己烷-異丙醇-乙酸（體積比 1∶1:0.01）進(jìn)行梯度洗脫，柱溫:35 ℃；進(jìn)樣量:5 μL；漂移管溫度:75℃；流動(dòng)相流量:0.5 mL/min。檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)產(chǎn)物組成

甘油與油酸反應(yīng)后的產(chǎn)物組分有TAG、FFA、1，3-DAG、1，2-DAG 和 MAG，如圖 1 所示:

圖1 反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相圖Fig.1 HPLC chromatograms of reaction products

2.2 真空脫水對(duì)酯化率的影響

適宜的水分含量是維持酶活力所必須的。但當(dāng)水分含量超過(guò)一定量后，脂肪酶的酯化活力會(huì)大大降低，而表現(xiàn)為較高的水解活力。在酶催化酯化反應(yīng)過(guò)程中，會(huì)生成水，水的存在不利于平衡向酯化方向進(jìn)行。因此，采用一定措施去除體系中過(guò)量的水使反應(yīng)平衡向合成方向移動(dòng)，不僅可以提高酶活，也可以增加酯化率。作者考察了常壓及真空條件下進(jìn)行的酯化反應(yīng)的進(jìn)程曲線。

圖2 脫水對(duì)1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化率的影響Fig.2 Effect of water removal on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖 2可知，在常壓下，反應(yīng) 2h，1，3-DAG含量和酯化率分別是48%和52%；在真空條件下，反應(yīng)2h，1，3-DAG含量和酯化率分別為62%和78%。之所以有這樣的差距，可能是因?yàn)楦视褪菢O性分子，在常溫常壓條件下甘油和脂肪酸供體之間的相容性很差，當(dāng)甘油和脂肪酸供體混合后與脂肪酶接觸時(shí)，極性的甘油分子傾向于包裹在脂肪酶上而造成酶的催化效率降低[8]。由此可見(jiàn)，在酯化生產(chǎn)1，3-DAG反應(yīng)中除去反應(yīng)生成的水分是十分必要的。

2.3 底物摩爾比的影響

任何一種底物摩爾數(shù)的改變，都會(huì)影響體系的穩(wěn)定性及產(chǎn)物的擴(kuò)散速率與含量，從理論上脂肪酸與甘油的摩爾比例在化學(xué)計(jì)量比 （2∶1）會(huì)使1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最佳。如果脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，則底物利用率不高；如果甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，不僅使體系的黏度加大，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，而且體系極性增加，甘油與脂肪酶易沉積在底部，難以與脂肪酸有效的混合，使反應(yīng)速率降低[9-10]。

作者以1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酯化率為指標(biāo)，研究了反應(yīng)溫度65℃，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物總質(zhì)量計(jì)），真空脫水（0.07MPa）的條件下，油酸、甘油的摩爾比對(duì)酯化合成1，3-DAG的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物摩爾比對(duì)1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化率的影響Fig.3 Effect of the molar ratio on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖3可知，1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著底物摩爾比（油酸與甘油的摩爾比）的增加而出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在底物摩爾比為2∶1時(shí)，反應(yīng)2 h，1，3-DAG得率最高，可達(dá)到62%，酯化率為78%。當(dāng)油酸與甘油的摩爾比例大于2∶1而小于3∶1（理論上生成TAG的比例）時(shí)，1，3-DAG得率和酯化率都會(huì)下降，這可能是因?yàn)轶w系中更多的油酸會(huì)趨向于轉(zhuǎn)化為TAG，所以造成DAG的得率下降，進(jìn)而1，3-DAG得率會(huì)下降。因此，反應(yīng)體系中底物摩爾比采用2∶1為宜。

2.4 酶量的影響

在油酸與甘油摩爾比為2∶1，反應(yīng)溫度為65℃， 真空脫水 （0.07 MPa），4%、6%、8%（底物總質(zhì)量計(jì)）作為酶量研究的變量條件下，考察了加酶量對(duì)1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶量對(duì)1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化率的影響Fig.4 Effect of enzyme load on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖4可知，當(dāng)酶量從2%增加到6%時(shí)，反應(yīng)到2h時(shí)，1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)從50%上升到62%；酯化率從52%上升到78%，當(dāng)繼續(xù)增加酶量到10%時(shí)，1，3-DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化率都是呈下降趨勢(shì)的，這可能是由于酶底物數(shù)量有限，達(dá)到飽和，并且固體脂肪酶量過(guò)大，反應(yīng)體系流動(dòng)性差，反應(yīng)一定程度受阻[11]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，1，3-DAG含量呈下降趨勢(shì)，而酯轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到4 h后，酯化率為94%后，基本保持不變，由此可見(jiàn)酯化率最高時(shí)，1，3-DAG含量并非最高，這可能是由于體系反應(yīng)過(guò)程中的?；D(zhuǎn)移產(chǎn)物中1，2-DAG和TAG含量增加存在所致，因此以后的研究中酶添加量采用6%為宜。

2.5 溫度的影響

適宜的溫度控制對(duì)酶催化反應(yīng)是重要的。脂肪酶來(lái)源不同，最適溫度也各不相同。一般而言溫度升高，有利于酯化反應(yīng)副產(chǎn)物水的脫除，加快反應(yīng)速率，但溫度過(guò)高，則會(huì)影響酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而降低酶活力。所以實(shí)驗(yàn)需控制適宜的反應(yīng)溫度。研究了不同的溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中1，3-DAG含量及酯化率的影響。如圖5所示。其他反應(yīng)參數(shù)為:油酸與甘油底物摩爾比2∶1，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物總質(zhì)量計(jì)），真空脫水（0.07 MPa）。

由圖5可知，隨著溫度的升高，1，3-DAG的含量和反應(yīng)初速度都是增加的，當(dāng)溫度為65℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，1，3-DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到61%，酯化率為78%。當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，1，3-DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和反應(yīng)初速度則降低。這可能是由于反應(yīng)溫度升高時(shí)，物質(zhì)在反應(yīng)體系中的溶解度會(huì)有很大提高，體系黏度低，傳質(zhì)速率就快，進(jìn)而反應(yīng)速度快。然而，隨著溫度的進(jìn)一步升高 （溫度高于65℃），熱力學(xué)平衡占據(jù)主導(dǎo)地位，?；灰圃黾樱?，2-DAG由4.1%上升至8.9%），使1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降[12]。另外可以看到，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，1，3-DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)5 h后趨于平衡，而酯化率則緩慢增加，當(dāng)4 h后保持不變。綜合考慮以上因素，選擇65℃作為反應(yīng)溫度較佳。

圖5 溫度對(duì)1，3-DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化率的影響Fig.5 Effect of temperature on 1，3-DAG yield and conversion rate

3 結(jié)語(yǔ)

采用RM IM酶催化脂肪酸與甘油合成1，3-DAG，利用真空脫水，油酸與甘油的摩爾比為2∶1，溫度為65℃，酶量為底物總質(zhì)量的6%時(shí)，1，3-DAG得率最高為62%。

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