紅旱蓮總黃酮對黃嘌呤氧化酶抑制作用及抗氧化研究

周 佳， 張國文， 胡明明

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330047）

黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，簡稱XOD）在核酸的分解代謝中起到重要的作用，其在催化黃嘌呤和次黃嘌呤氧化的過程中不僅會生成尿酸而且能夠產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫等過氧化物自由基。尿酸濃度過高會導(dǎo)致高尿酸血癥并引起痛風(fēng)發(fā)作[1]，過氧化物自由基在體內(nèi)積累導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和自由基損傷與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，如衰老、腫瘤、心腦血管疾病[2-3]。因此黃嘌呤氧化酶抑制劑不僅能夠預(yù)防及治療痛風(fēng)病癥而且具有間接減少體內(nèi)自由基的作用。

紅旱蓮為藤黃科、金絲桃屬多年生草本植物，主要分布在我國東北地區(qū)及黃河、長江、珠江流域。全草入藥，有平肝、止血、敗毒和消腫的作用[4]。據(jù)研究報道，紅旱蓮中主要的活性成分為槲皮素、山奈酚、金絲桃苷等黃酮類和氧雜蒽酮類化合物[5]，其提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、組胺釋放抑制等作用[6]。近年來由于氧雜蒽酮類化合物在抗抑郁癥方面的作用使紅旱蓮受到了廣泛的關(guān)注，然而對于紅旱蓮中類黃酮的生物活性研究較少。作者通過對紅旱蓮總黃酮抑制黃嘌呤氧化酶及其抗氧化能力的研究，評價紅旱蓮總黃酮的相關(guān)生物活性，以期為合理開發(fā)利用紅旱蓮資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅旱蓮，購于河北安國中藥材市場，產(chǎn)地湖南。50℃烘干后粉碎過60目篩。

總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；蘆丁:中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；黃嘌呤氧化酶（35.7 U/mL）、黃嘌呤:北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；別嘌呤醇:Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì):日本島津公司產(chǎn)品；F-4500型熒光光度計(jì):日本日立公司產(chǎn)品；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇榮華儀器制造產(chǎn)品；pHS-3C型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 提取液經(jīng)NKA-9大孔樹脂初步純化。純化后的紅旱蓮黃酮溶液在45℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為棕黃色膏狀物后真空冷凍干燥。高效液相色譜分析得出純化物主要含有斛皮素、山奈酚、金絲桃苷、蘆丁、異斛皮素等黃酮類成分，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.7%。

1.2.2 XOD抑制作用 XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸并在290 nm處有特征吸收峰，采用紫外分光光度計(jì)的動力學(xué)/時間軟件每隔10 s測定一次吸光度，共測20次，在這段時間內(nèi)吸光度隨時間呈線性增加，斜率為反應(yīng)速率（斜率越大，說明酶的活力越強(qiáng)）[2]。 移取 1.75 mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.5）、0.05 mL樣品溶液和0.03 mL黃嘌呤氧化酶溶液（終活力3 mU/mL）混合，30℃水浴5 min后加入0.17 mL底物溶液黃嘌呤（0.6 mmol/L）啟動反應(yīng)，測定290 nm波長處的吸光度變化并計(jì)算斜率R。以緩沖液代替底物溶液，與上述樣品相同處理作為空白對照，記錄吸光度的變化并計(jì)算斜率R0。不加抑制劑時酶的活性定義為100%相對活性，通過式（1）計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)條件下的黃嘌呤氧化酶相對活性[7]。

1.2.3 XOD抑制可逆性研究 在測定體系中，固定底物的最終濃度（0.05 mmol/L）不變，改變黃嘌呤氧化酶濃度（1～4 mu/mL），測定不同抑制劑濃度下（1～7 μg/mL），酶的活力對最大反應(yīng)速率的影響。

1.2.4 XOD抑制動力學(xué)研究 在測定體系中，固定酶的終濃度（3 mU/mL），測定不同質(zhì)量濃度抑制劑（0～10 μg/mL） 條件下， 黃嘌呤的濃度 （0.05～0.2 mmol/L）對反應(yīng)速率的影響，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，推斷抑制類型。在Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中求得不同質(zhì)量濃度抑制劑下的Kmapp值，并以Kmapp值對相應(yīng)抑制劑質(zhì)量濃度作圖，直線延長與橫軸交點(diǎn)即為Ki。

1.2.5 羥基自由基清除能力 根據(jù)chung等的方法略作修改[8]。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制不同質(zhì)量濃度的紅旱蓮黃酮溶液并分別取2.4 mL于10 mL比色管中，加入0.8 mL 5 mmol/L的硫酸亞鐵-EDTA溶液和0.4 mL 10 mmol/L的苯甲酸鈉溶液，再加入0.4 mL 10 mmol/L的雙氧水溶液。37℃恒溫水浴反應(yīng)2 h后，測定418 nm處溶液的熒光強(qiáng)度。按照式 （2）計(jì)算紅旱蓮總黃酮的羥基自由基清除率。

式中F1和F2分別為未加入和加入不同質(zhì)量濃度紅旱蓮總黃酮后反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度；F0為pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 總還原能力測定 參考Vaquero等[9]的方法。用蒸餾水將紅旱蓮總黃酮配成不同質(zhì)量濃度的溶液，取2.4 mL樣品溶液、2.5 mL鐵氰化鉀溶液（1 g/dL）、2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），混勻。 50 ℃恒溫水浴20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10 g/dL），混合溶液。取5 mL經(jīng)3 000 r/min離心10 min的混合溶液于10 mL比色管中，加入1 mL三氯化鐵溶液（0.1 g/dL）并用二次蒸餾水定容至10 mL?；靹颍o置10 min后，在700 nm波長處測定其吸光值。

1.2.7 總抗氧化能力測定 紅旱蓮總黃酮總抗氧化能力采用試劑盒進(jìn)行測定。用二次蒸餾水將紅旱蓮總黃酮配成不同質(zhì)量濃度的溶液，按照試劑盒給出步驟進(jìn)行操作，測定520 nm處反應(yīng)體系的吸光度?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)均使用維生素C（VC）做陽性對照。試劑盒定義為每分鐘每毫升樣品溶液使反應(yīng)體系的吸光度（A）值增加0.01為一個總抗氧化能力單位[10]。通過式（3）計(jì)算紅旱蓮黃酮的總抗氧化能力。

式中:AU、AC分別為測定管和對照管在波長520 nm處的吸光度值；Vt為反應(yīng)溶液的總體積；V0為樣品溶液的體積；N為樣品溶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 XOD抑制作用研究

圖1為不同質(zhì)量濃度下紅旱蓮總黃酮對XOD的抑制作用。在2～40 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，XOD的活性隨著紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度的增加而逐漸下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系。紅旱蓮總黃酮半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）為 11.73 μg/mL，陽性對照別嘌呤醇（AIIopurinol） IC50為 0.579 μg/mL。 紅旱蓮總黃酮顯示出一定的XOD抑制作用。

圖1 紅旱蓮總黃酮及對照對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of HAF and AIIopurinol on xanthine oxidase

2.2 XOD抑制可逆性判斷

如圖2所示，不同質(zhì)量濃度抑制劑條件下，XOD的反應(yīng)速率對酶的濃度作圖得到一系列通過原點(diǎn)但斜率不同的直線，且隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加直線的斜率不斷降低。由此推斷紅旱蓮總黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制作用屬于可逆抑制作用[11]。

圖2 紅旱蓮總黃酮的抑制可逆性研究Fig.2 Reversible research of HAF

2.3 XOD抑制動力學(xué)研究

可逆型抑制劑與酶的作用方式包括競爭性、非競爭性、反競爭性和線性混合性幾種類型。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，根據(jù)酶催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)表觀米氏常數(shù)（Kmapp）和最大反應(yīng)速度（Vm）的變化來判斷抑制類型。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖為相交于縱坐標(biāo)的一組直線（圖3），表明隨著反應(yīng)體系紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度的增大，體系最大反應(yīng)速率保持不變，而Kmapp值顯著增大，符合競爭性抑制類型的特征[12]。因此，紅旱蓮總黃酮對XOD抑制作用的動力學(xué)特征為競爭性抑制類型，求得其抑制常數(shù)Ki=0.61 μg/mL。

2.4 紅旱蓮總黃酮羥基自由基清除能力

苯甲酸鈉是一種弱熒光物質(zhì)，當(dāng)它與羥基自由基結(jié)合時熒光強(qiáng)度會明顯增加，因此能夠通過檢測苯甲酸鈉體系熒光強(qiáng)度的變化，評估羥基自由基的清除情況[8]。如圖4所示，紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度與羥基自由基清除率呈正相關(guān)，當(dāng)紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL上升為0.5 mg/mL時，羥基自由基的抑制率也由 （38.48±1.41）%增加至 （94.05±1.80）%。在相同質(zhì)量濃度下紅旱蓮總黃酮的清除率高于陽性對照VC （P＜0.01）。 其半抑制率 （IC50=0.135 μg/mL）低于 VC（IC50=0.192 μg/mL），表明紅旱蓮總黃酮對羥基自由基有很強(qiáng)的清除能力。

圖3 紅旱蓮總黃酮抑制黃嘌呤氧化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plots for inhibition of HAF on xanthine oxidase

圖4 紅旱蓮總黃酮羥基自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging effect of HAF

2.5 紅旱蓮黃酮總還原能力

在反應(yīng)體系中，紅旱蓮黃酮能夠還原Fe3+/鐵氰酸鹽化合物成亞鐵狀態(tài)。而Fe2+在溶液體系中呈普魯士藍(lán)色，能夠在700 nm波長處進(jìn)行檢測，吸光值越大說明還原能力越強(qiáng)[13]。圖5顯示了不同質(zhì)量濃度的紅旱蓮總黃酮的總還原能力。在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅旱蓮黃酮的總還原能力隨著濃度的增大而逐漸增加，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。當(dāng)紅旱蓮質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，其總還原能力與0.4 mg/mL VC的總還原能力相當(dāng)。

2.6 紅旱蓮黃酮總抗氧化能力

紅旱蓮總黃酮的總抗氧化能力如圖6所示。在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化能力顯著提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時總抗氧化能力達(dá)到113，雖不及同質(zhì)量濃度下VC的總抗氧化能力，但仍顯示出一定的抗氧化能力。

圖5 紅旱蓮總黃酮總還原能力Fig.5 Total reductive ability of HAF

圖6 紅旱蓮總黃酮總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant ability of HAF

3 結(jié)語

研究表明，在2～40 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅旱蓮總黃酮對黃嘌呤氧化酶（XOD）的抑制呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其IC50值為11.73 μg/mL，當(dāng)紅旱蓮總黃酮質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，XOD的相對活性只有18.6±2.7%，其抑制類型是一種可逆的競爭性抑制劑，抑制常數(shù)為0.61 μg/mL。雖然臨床上使用的XOD抑制劑別嘌呤醇對XOD活性有很強(qiáng)的抑制作用（本研究中作為陽性對照，測得其IC50值為0.579 μg/mL），但別嘌呤醇會誘發(fā)胃腸道反應(yīng)、中毒性肝炎及血液中白細(xì)胞和血小板減少等副作用[2]，導(dǎo)致其使用在一定程度上受到限制。此外，紅旱蓮總黃酮還顯示出很強(qiáng)的羥基自由基清除能力（優(yōu)于VC）及較好的總還原能力和總抗氧化能力。紅旱蓮是一種草本植物，毒副作用小，其主要有效成分類黃酮可作為潛在的預(yù)防高尿酸血癥的藥物和抗氧化劑進(jìn)行深入研究。

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