退變頸椎椎間盤纖維環(huán)成纖維細胞成骨分化與頸椎病

姚 承，盧旭華

頸椎病是一種緩慢進展的退行性病變?，F(xiàn)有研究認為該病是以頸椎椎間盤退變?yōu)榛A(chǔ)病理進而造成椎間隙變窄、關(guān)節(jié)囊松弛以及進行性骨贅形成，進而分別刺激、壓迫相鄰的頸脊神經(jīng)根、頸脊髓，椎動脈、椎旁交感神經(jīng)等神經(jīng)血管組織所致。

前人對于頸椎椎間盤的退變研究主要集中在髓核，對于頸椎椎間盤纖維環(huán)退變后的轉(zhuǎn)歸及加速退變誘因、是否參與椎體后緣骨贅形成尚無定論。以往研究證明，成纖維細胞在誘導(dǎo)因素下具有成骨能力，并可以轉(zhuǎn)化為成骨細胞［1］。本文擬對頸椎椎間盤纖維環(huán)的退變性成骨分化及其與頸椎病關(guān)系的研究做一綜述。

1 牽張力對頸椎椎間盤纖維環(huán)成纖維細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的影響研究

一般認為在低頭屈曲工作狀態(tài)下頸椎應(yīng)力較大造成退變加速。但高牽張力作用下頸椎椎間盤纖維環(huán)中的成纖維細胞會發(fā)生什么樣的轉(zhuǎn)歸化生尚不明確。

目前對于牽張力作用下成纖維細胞的轉(zhuǎn)歸有過多種多樣的研究，王永等［2］實驗表明，一定力值范圍內(nèi)的機械牽張力能促進成纖維細胞增值，且細胞增殖與力值呈相反關(guān)系。然而超過范圍的過大力值(3 000 με)的牽張力則明顯抑制成纖維細胞增殖。該結(jié)果得到相關(guān)動物實驗的支持。吳漢江等［3］的實驗也表明適當(dāng)?shù)臓繌埩Υ碳び欣诟纳萍毎δ芎突钚?，但是長期和較大的牽張力會引起細胞損傷，反而阻礙軟骨細胞的分化增殖抑制細胞的活力。同一大小的牽張力對不同年齡的兔鼻軟骨細胞的增值活性變化的影響不同，牽張力對于新生兔體外培養(yǎng)的兔鼻軟骨的促增值作用更加明顯?？梢岳斫鉃樾律帽擒浌羌毎^之6 周齡兔兔鼻軟骨細胞在牽張力刺激下產(chǎn)生的具有促進增值作用的細胞因子的能力更強，因此對牽張力的刺激更加明顯。而在駱泉豐等［4］的實驗中未觀察到牽張力直接引起成纖維細胞向成骨細胞的轉(zhuǎn)化。在以前的實驗中，曾觀察到牽張力可以刺激成骨細胞分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，這2 種因子在誘導(dǎo)成纖維細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中起到非常重要的作用。因此，牽張力對成纖維細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化可能起到一個間接的促進作用。大量實驗表明適當(dāng)?shù)膽?yīng)力載荷可以促進成骨細胞內(nèi)的力敏感基因表達［5］。如早期的反應(yīng)基因、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素、BMP 及其受體、膠原蛋白、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、TGF-β、堿性成纖維細胞生長因子(basylous fibroblast growth factor，bFGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)等，都在牽張成骨新骨生成過程中都扮演了重要的角色。Knoll 等［6］研究結(jié)果顯示，牽張力數(shù)值過大或者過小都難以獲得促進細胞增值的最佳效果。低水平的牽張力不足以維持骨的形成，使骨的吸收大于形成;250～2 500με 的力值可為骨組織的形成提供有效的刺激;但是當(dāng)力值超過2 500με 雖然可以刺激骨形成，但是骨吸收的速度也大大加快。在以往的研究中，都得出了牽張力對于成纖維細胞可能存在間接或直接的作用，促進成纖維細胞增殖以及骨化;而牽張力過大，可能會抑制損傷細胞。但是，針對頸椎椎間盤纖維環(huán)的成纖維細胞骨化過程則缺少比較直接的實驗數(shù)據(jù)，以徹底闡明在纖維環(huán)骨化過程中牽張力所扮演的角色。

2 頸椎椎間盤軟骨細胞的成骨誘導(dǎo)作用

頸椎椎間盤由上下軟骨板、中間的髓核和周圍纖維環(huán)組成。那么在頸椎病發(fā)病過程中頸椎椎間盤纖維環(huán)中的軟骨細胞和成纖維細胞之間是否存在相互作用、是否存在軟骨細胞的成骨誘導(dǎo)作用以及這個交互作用是否對頸椎病的形成有促進?

纖維細胞由外周血中成纖維細胞轉(zhuǎn)化而成，具有間充質(zhì)干細胞的特點。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植治療軟骨缺損成為研究的熱點并在臨床范圍得到應(yīng)用。Wakitani 等［7］將患者自體BMSCs 接種于膠原水凝膠并結(jié)合骨膜瓣覆蓋治療髕骨軟骨缺損，術(shù)后6 個月發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)功能顯著改善。Wakitani 等［8］報道采用自體BMSCs 移植治療12 例由骨性關(guān)節(jié)炎引起的股骨髁軟骨損傷，術(shù)后42 周發(fā)現(xiàn)損傷部位由透明軟骨與軟組織填充，組織學(xué)觀察與對照組無顯著差異。

因此，軟骨細胞具有誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化的作用，而成纖維細胞作為具有BMSCs 特點的細胞，在體內(nèi)會在軟骨細胞誘導(dǎo)下產(chǎn)生新的成骨分化。

張偉等［9］認為，核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)在成纖維細胞成骨誘導(dǎo)以及成纖維細胞、軟骨細胞的相互作用中起重要地位。成纖維細胞和成骨細胞和軟骨細胞均來源于間充質(zhì)干細胞，在內(nèi)源基因的表達上具有很高的相似性，且cbfα1 在成纖維細胞中并無表達。實驗證明cbfα1可能參與了軟骨細胞的發(fā)育調(diào)控，有可能在體外通過影響cbfα1 從而影響軟骨細胞與成纖維細胞的相互作用。Choi 等［10］認為人類組織中的纖維細胞有分化成成骨細胞和軟骨細胞的潛能。研究人員把分離的纖維細胞和成骨祖細胞體外作對比，在相同的成骨培養(yǎng)基條件下，2 種細胞均向成骨細胞分化并伴隨鈣鹽沉積和成骨基因上調(diào)。相反，研究人員把分離的纖維細胞和人間充質(zhì)干細胞在含有TGFβ 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 種細胞都向軟骨細胞分化。

宇麗等［11］通過實驗證明堿性成纖維細胞可以促進軟骨等結(jié)締組織細胞的有絲分裂活動，主要是通過與靶細胞上的受體結(jié)合發(fā)揮作用。而在不同來源的軟骨細胞中，各種堿性成纖維細胞受體所介導(dǎo)的作用不同。堿性成纖維細胞在一定濃度范圍內(nèi)，對軟骨細胞增值的刺激作用表現(xiàn)出量效關(guān)系。但是，當(dāng)應(yīng)用濃度超過其最佳濃度時，其刺激增值效果不再隨劑量提高。有研究證明在單層培養(yǎng)條件下，堿性成纖維細胞有助于維持軟骨細胞的再分化能力，能阻止去分化現(xiàn)象的發(fā)生。即使是在單層培養(yǎng)體系中已經(jīng)發(fā)生去分化的軟骨細胞，在轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)體系中仍能發(fā)生再分化。劉霞等［12］在實驗中證明軟骨細胞與成纖維細胞在體外共培養(yǎng)12 周后，軟骨細胞與成纖維細胞體外共培養(yǎng)能形成軟骨樣組織。陽性對照組以及共培養(yǎng)組均形成成熟的軟骨樣組織，組織學(xué)及免疫組化顯示有成熟的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)及Ⅱ型膠原表達。共培養(yǎng)組在培養(yǎng)過程中稍有縮小，在復(fù)合物的周邊區(qū)域形成了均質(zhì)的軟骨樣組織，但是在近中心區(qū)域存在一定量的纖維性組。

上述文獻提示:軟骨細胞和成纖維細胞作為同源細胞，成纖維細胞具有成骨潛能;兩者共同培養(yǎng)具有一定的相互作用。

3 頸椎椎間盤成纖維細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的研究

頸椎椎間盤成纖維細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的過程，在國內(nèi)外都有相關(guān)研究。Nagano 等［13］等認為隨著椎間盤的退變，纖維環(huán)中的成纖維細胞增生化生為軟骨細胞。其增殖越過椎間盤邊緣進而產(chǎn)生軟骨內(nèi)骨化形成骨贅纖維環(huán)中成纖維細胞的退變，軟骨化生是椎間盤病變的病理基礎(chǔ)。

盧旭華等［14］利用細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，建立頸椎病患者的頸椎椎間盤纖維環(huán)中成纖維細胞的培養(yǎng)體系觀察其在細胞因子重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Rh-bone morphogenetic protein 2，rhBMP2)，TNF-α培養(yǎng)液誘導(dǎo)下的成骨表現(xiàn)。證明頸椎椎間盤纖維環(huán)成纖維細胞存在成骨潛能。rhBMP-2 對纖維環(huán)成纖維細胞有明確的體外誘導(dǎo)成骨作用以及纖維環(huán)成纖維細胞的骨化在頸椎退變的病理過程中有重要作用。

而在頸椎椎間盤纖維環(huán)成骨潛能研究的動物實驗中觀察到:頸椎椎間隙植骨材料中單純植入纖維環(huán)組織后在術(shù)后6 周時組織切片內(nèi)有纖維軟骨存在，12 周新生軟骨存在?？瞻讓φ战M術(shù)后6 周組織學(xué)觀察無陽性染色結(jié)果［15］。因此推測，頸椎椎間盤纖維環(huán)組織的成骨形式很有可能是成纖維細胞的軟骨化骨生成。

在李博等［16］的實驗中證明，聯(lián)合使用rhBMP2和bFGF 能夠明顯促進椎間盤細胞增值，提高細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活力、增加Ⅰ型膠原分泌、提高鈣鹽沉積程度、提高骨鈣素的表達水平。RhBMP2 能夠誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細胞不可逆的分化形成骨和軟骨。但是rhBMP2 只是骨生成的啟動因子，對已分化的成骨細胞沒有進一步的促增值作用。bFGF 能夠促進骨細胞的增值和分化，RhBMP2 啟動骨形成過程后為bFGF 提高大量的靶細胞。但另一方面bFGF 沒有異位誘導(dǎo)的成骨活性，rhBMP2 的成骨誘導(dǎo)作用又可彌補bFGF 的不足。從而使二者在生物學(xué)的功能上形成互補，加速骨誘導(dǎo)、骨形成的過程。Varkey 等［17］在文獻中指出，體內(nèi)體外的差異、培養(yǎng)液的成分以及細胞供體年齡、細胞因子的作用時間都能影響細胞因子的促成骨效應(yīng)。

4 成纖維細胞成骨誘導(dǎo)分化的信號通路調(diào)控作用的研究

目前研究認為在成纖維細胞向成骨細胞分化的過程中，受到多種信號通路調(diào)控。其中TGF-β/BMPs［18］、Wnt、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPK)信號通路發(fā)揮了重要作用。而且通過對smad1 蛋白酶體的調(diào)節(jié)，Wnt和MAPK 信號通路可以對TGF-β/BMPs 通路進行調(diào)控，在相關(guān)信號通路的共同作用下使成纖維細胞骨化。

Jaiswal 等［19］發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)成人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化時有細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路的激活。ERK 阻斷劑PD98059 能劑量依賴性的阻斷其向骨組織分化，并且出現(xiàn)向脂肪組織分化的傾向。P38MAPK 主要接受生理性應(yīng)激、內(nèi)毒素、滲透性應(yīng)激、紫外線等刺激［20］。Raingeaud 等［21］以小鼠間充質(zhì)干細胞為樣本誘導(dǎo)向成骨細胞分化，分別加入ERK 以及P38MAPK 抑制劑，發(fā)現(xiàn)P38MAPK 的抑制劑能明顯減弱小鼠間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化。萬曉晨等［22］認為，在MAPK 通路中，ERK、Jun激酶(jun kinase，JNK)和P38 可通過磷酸化Smads控制其體內(nèi)和體外的功能。MAPK 磷酸化Smad1 MH1、MH2 連接區(qū)的保守的積聚以抑制BMP 目的基因的表達。因此，F(xiàn)GF 或Ras 活化的MAPK 信號通路，可以間接調(diào)節(jié)BMP 通路的活性。研究表明，MAPK 樣Nemo 激酶可以磷酸化果蠅的Smad，促進其出核抑制BMP 通路的活性［23］?？拙S霞等［24］在實驗中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞在成骨分化過程中MAPK通路所包含的ERK、JNK 和p38 通路均發(fā)生活化;加入PD98059 后，ALP 的表達在誘導(dǎo)早期顯著提高，而后無顯著改變。加入JNK 2 后，不影響ALP和鈣的沉積;而加入P38MAPK 抑制劑(SB203580)后，可顯著抑制ALP 的表達和鈣的沉積。P38 通路在間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)向成骨分化中起正調(diào)控作用，ERK 通路可能早期起負調(diào)控作用，而JNK 通路在其中未見顯著作用。

成纖維細胞具有間充質(zhì)干細胞的特點，上述細胞通路對成纖維細胞的成骨化生可能也存在類似的影響。

5 分析與展望

頸椎病在人群中發(fā)生率高，尤其在當(dāng)今社會，由于人們生活和勞動內(nèi)容的變化，發(fā)病人群趨于年輕化。隨著對本病的研究不斷深入，其發(fā)病機理不斷不斷被闡明，也不斷有新的認識產(chǎn)生。對于造成脊髓壓迫主要因素椎體后緣骨贅的形成機制研究會有助更好的預(yù)防和治療頸椎病。

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