藥用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的影響因素研究進展

張敏敏，陳玉梁，趙 瑛，張運暉，羅俊杰

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

植物是藥物的重要來源之一，人類利用藥用植物的歷史淵遠流長。我國藥用植物的種質(zhì)資源非常豐富，達10 000種以上，且大多為野生資源。由于傳統(tǒng)中草藥的獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導(dǎo)致物種瀕危甚至滅絕，因此，利用植物組織和細胞的大量培養(yǎng)合成中藥有效成分成為實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的一條重要途徑［1］。適宜的離體培養(yǎng)條件下，植物組織和細胞培養(yǎng)物能像植物體一樣進行次生代謝，并積累次生代謝產(chǎn)物［2］。藥用植物的有效成分也屬于植物細胞所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、黃酮、萜類、皂甙等。由于這些化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，因此植物組織和細胞培養(yǎng)方法則展現(xiàn)出無可比擬的優(yōu)越性。而藥用植物的組織和細胞培養(yǎng)價值如何，主要取決于其合成的有效成分與自然植株間的差異，而誘導(dǎo)成分的產(chǎn)生受到培養(yǎng)條件的多重影響。近年來國內(nèi)外在基本培養(yǎng)條件和附加物的添加對藥用植物組織和細胞培養(yǎng)合成次生代謝產(chǎn)物的影響方面進行了許多研究，我們對該領(lǐng)域的相關(guān)研究進行了歸納和總結(jié)。

1 研究進展

1.1 外植體對合成次生代謝產(chǎn)物的影響

植物細胞雖均有全能性，但在實驗過程中，不同外植體的愈傷誘導(dǎo)率和愈傷生長狀態(tài)各不相同，且不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織其次生代謝產(chǎn)物的種類及產(chǎn)量也不盡相同。甘草以下胚軸為外植體時愈傷誘導(dǎo)率最高，且不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量不同，表現(xiàn)為下胚軸愈傷組織中總黃酮含量最高，子葉愈傷組織中甘草酸含量最高［3］；在對朱砂根愈傷組織的誘導(dǎo)中，各外植體的誘導(dǎo)率雖較為一致，但以胚根為外植體的愈傷組織中巖白菜素含量高于其它愈傷組織［4］。因此，外植體的選擇是利用植物組織和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物有效成分的前提。

1.2 培養(yǎng)基對合成次生代謝產(chǎn)物的影響

1.2.1 基本培養(yǎng)基 不同種類的基本培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物的形成有很大的影響。如紫草在White培養(yǎng)基上能夠合成紫草寧衍生物，而在LS等培養(yǎng)基上則不能合成［5］；又如B5培養(yǎng)基有利于杜仲愈傷組織中總黃酮的形成，而1/2MS培養(yǎng)基則有利于綠原酸的積累［6］；嚴海燕等對硬紫草的研究表明，改良的B5培養(yǎng)基有利于愈傷組織的生長，而M9培養(yǎng)基有利于紫草素的形成，于是選擇了以B5培養(yǎng)基為生長培養(yǎng)基，而M9培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基的兩階段培養(yǎng)技術(shù)［7］。這種兩步培養(yǎng)法較好的解決了細胞生物量增長與次生代謝產(chǎn)物積累之間的矛盾，大大提高了目標產(chǎn)物的產(chǎn)率，現(xiàn)已較廣泛地應(yīng)用于黃連、黃花蒿等藥用植物的培養(yǎng)中。

1.2.2 碳源 碳源不僅能為細胞生長提供能量，同時也是碳骨架的組成成分。在1987年，Smith等對長春花的研究即發(fā)現(xiàn)，以乳糖替代蔗糖可明顯提高組織培養(yǎng)物的生物量和長春質(zhì)堿的產(chǎn)量［8］；李琰等對雷公藤的研究表明，蔗糖有利于雷公藤愈傷組織的生長，麥芽糖有利于其內(nèi)脂醇的合成，葡萄糖則有利于其總生物堿的積累［9］?？梢娺x擇適宜的碳源對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有促進作用。

1.2.3 氮源 不同植物對NO3-和NH4+的利用率不同，且單獨以硝酸鹽或銨鹽為氮源，都不利于細胞的生長和次級代謝物的生成。因此，設(shè)置適宜的氮源及比例有助于細胞生長和次生代謝產(chǎn)物的生成。如在水母雪蓮懸浮細胞培養(yǎng)中，氮源總量為60～120mmol/L，且NO3-/NH4+比例為4∶2時有利于細胞增長及黃酮的合成［10］；而玫瑰茄懸浮細胞培養(yǎng)中，氮源總量為13.5 mmol/L時即足夠維持玫瑰茄細胞的生長和花青素的合成，且當NO3-/NH4+比例為25∶2和25∶4時細胞生長和花青素合成最佳［11］；甘草愈傷組織培養(yǎng)中，總氮濃度為60mmol/L，NO3-/NH4+為2∶1時，甘草愈傷組織中5種黃酮類化合物含量的總和達到最大值［12］。

1.2.4 生長調(diào)節(jié)劑 植物組織和細胞培養(yǎng)中最常用的生長調(diào)節(jié)劑是生長素和細胞分裂素。生長素主要包括2，4-D、IAA、IBA、NAA等，細胞分裂素包括BA、2ip、KT等。生長調(diào)節(jié)劑不僅對愈傷組織的生長和分化狀態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時對次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)也具有重要的影響。如在三分三愈傷組織培養(yǎng)中，低濃度2，4-D能刺激生物堿的合成，但延緩生長；高濃度2，4-D雖能刺激愈傷組織生長但抑制生物堿的合成。而NAA既能促進愈傷組織生長又能促進生物堿的合成［13～14］。雷公藤愈傷組織培養(yǎng)中，2，4-D有利于雷公藤愈傷組織生長和總生物堿的積累，6-BA抑制愈傷組織生長但明顯促進內(nèi)酯醇的形成［8］。可見植物生長調(diào)節(jié)劑是藥用植物有效成分目的化生產(chǎn)的重要因素之一。

1.2.5 光照 光照對藥用植物組織和細胞培養(yǎng)的影響主要體現(xiàn)在光強、光質(zhì)及光照時間三個方面。如在不同光照強度下對虎杖愈傷組織進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織中白藜蘆醇的含量從大到小依次為弱光、強光、暗光，且弱光下白藜蘆醇的含量是同期所采野生品種的2倍［15］；又如以不同光質(zhì)對朱砂根愈傷組織進行處理，發(fā)現(xiàn)綠光最利于巖白菜素的生成，藍光和白光次之，紅光最差［16］；在杜仲愈傷組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，12 h/d光照對愈傷組織的生長及綠原酸和總黃酮的合成有明顯的促進作用，黑暗雖不影響愈傷組織的生長，但卻抑制綠原酸和總黃酮的形成［17］。

1.2.6 pH 盛長忠等的研究表明，南方紅豆杉的愈傷組織生長及紫杉醇含量受pH的影響較大，pH為5.5時對愈傷組織生長最為有利，達接種量的3.84倍；但紫杉醇的含量較低且pH為7.0時，愈傷組織的生長量雖然相對較低，但紫杉醇含量卻是pH為5.5時的2倍多［18］。因此，選擇適宜的pH值對于植物組織的生長及次生代謝產(chǎn)物的合成也有一定的促進作用。

1.3 附加物對藥用植物組織和細胞培養(yǎng)及有效成分生產(chǎn)的影響

植物次生代謝產(chǎn)物是一大類小分子化合物，基礎(chǔ)含量一般都很低。而在生物受到脅迫或出于一定的誘導(dǎo)條件下，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量通常都有一定的提高［19］，因此，鹽脅迫、旱脅迫等脅迫因子以及誘導(dǎo)子的特殊誘導(dǎo)作用受到廣泛關(guān)注。同時，隨著次生代謝產(chǎn)物合成途徑的進一步闡明，前體物質(zhì)和相關(guān)代謝酶的添加也成為提高目的產(chǎn)物的有效手段。

1.3.1 誘導(dǎo)子的應(yīng)用 從植物病理學(xué)的角度講，誘導(dǎo)子是指在抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植保素和引起植物過敏反應(yīng)的因子，從細胞培養(yǎng)的角度講是指能促進植物細胞產(chǎn)生目的產(chǎn)物因子［20］。根據(jù)這個原理，近年來該項研究已成為國內(nèi)外研究的熱點，并取得了較大的進展。如Lu等發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子的加入能使人參懸浮細胞中的皂甙含量達到細胞干重的2.07%，是未加誘導(dǎo)子的28倍［21］。Wang等發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉的細胞培養(yǎng)中加入100 uM的茉莉酸甲酯作為誘導(dǎo)子，紫杉醇的含量能提高到對照的25.7倍［22］。文濤等以黑曲霉、啤酒酵母、青霉、灰葡萄孢的提取物為真菌誘導(dǎo)子對虎杖愈傷組織進行處理，結(jié)果為黑曲霉、青霉、灰葡萄孢3種真菌誘導(dǎo)子均對白藜蘆醇的合成有促進作用，其中黑曲霉作用最顯著，比對照提高了50.2%，而啤酒酵母提取物對白藜蘆醇的合成具有抑制作用［23］。楊世海等以稀土元素作為新型誘導(dǎo)子，也取得了喜人的結(jié)果，即低濃度的稀土元素Eu3+對甘草愈傷組織中黃酮類化合物的合成具有明顯的促進作用，且當其濃度為0.1 mg/L時最有利于黃酮類化合物的積累，總黃酮含量可為對照的2.7倍，其中甘草素的含量是對照的4倍［24］?？梢娺x擇適宜的誘導(dǎo)子對藥用植物組織和細胞培養(yǎng)及有效成分的積累具有積極的促進作用。

1.3.2 前體物質(zhì)及代謝酶的影響 前體物質(zhì)指某一代謝中間體前一階段的物質(zhì)，添加前體物質(zhì)會影響植物組織和細胞的生長及次生代謝產(chǎn)物的合成。Zhao等在培養(yǎng)長春花細胞的系統(tǒng)中加入琥珀酸色氨和色氨酸等前體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)處理后細胞產(chǎn)生的長春花堿和西蘿芙木堿是未經(jīng)處理的4倍多［25］。Fett-Neto的實驗發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉細胞培養(yǎng)中加入前體物質(zhì)苯丙氨酸能使紫杉醇含量提高5倍［26］。而代謝酶的研究目前主要是應(yīng)用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的方法分離和克隆出代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，并經(jīng)過修飾和載體構(gòu)建后轉(zhuǎn)化到目的植物的基因組中，從而構(gòu)建目的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)細胞系。如Canel和Geerlings對長春花的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶與長春花細胞合成吲哚類和喹啉類生物堿相關(guān)，采用分子遺傳學(xué)方式超量表達這兩種酶后，生物堿產(chǎn)量達到200 mg/L的高水平，說明這兩種酶對長春花生物堿的合成具有明顯促進作用［27～28］。Yamamura等和Yamamoto等分別研究了桂皮酸羥化酶和牦牛酸氫醌羥化酶對紫草細胞中紫草素合成的影響，結(jié)果這兩種酶在紫草細胞內(nèi)的表達量與紫草素的合成速度明顯相關(guān)，并已將其基因克隆，同時說明了通過外源基因調(diào)節(jié)紫草素的合成是可能的［29～30］。可見目的產(chǎn)物代謝途徑的研究對提高其產(chǎn)量具有重要的意義。

2 展望

1952年Routien和Nickel首次提出用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)能生產(chǎn)有用次級代謝產(chǎn)物的觀點開始［31］，利用植物組織和細胞培養(yǎng)方法合成天然產(chǎn)物的研究便迅速地發(fā)展起來。如今已能利用紫草細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧，紅豆杉細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉醇等已達到工業(yè)化生產(chǎn)水平，其他藥用植物利用組織和細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)有效成分也取得了很大的成就，但達到商業(yè)化生產(chǎn)水平的應(yīng)用并不多，很多藥用植物組織和細胞的次生代謝產(chǎn)物含量不及原植物，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高。因此控制和調(diào)節(jié)藥用植物組織和細胞培養(yǎng)及有效成分合成中的相關(guān)可控條件，進一步加強對誘導(dǎo)子作用機制和目的產(chǎn)物代謝途徑的研究，對提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有著重要的現(xiàn)實意義，同時也將進一步推進利用藥用植物組織和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的工業(yè)化進程。

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