中樞神經(jīng)損傷后GAP-43蛋白對神經(jīng)再生及軸突導(dǎo)向作用及其機制的研究進展

劉 健，楊小玉，楊茂光，矯健航，董 健，夏威威（.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌443003；

2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院脊柱外科，吉林 長春 130033）

中樞神經(jīng)損傷通常導(dǎo)致?lián)p傷部位支配的感覺及運動功能喪失。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后其損傷的軸突自發(fā)性再生能力十分有限，因此中樞神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點之一。大量研究[1]表明：大腦或脊髓損傷后人為給予藥物干預(yù)或?qū)κ窠?jīng)支配的肢體進行相關(guān)功能鍛煉，均可以使患者或?qū)嶒瀯游锉疽褑适У墓δ塬@得明顯恢復(fù)。這些方法的直接證據(jù)是促進損傷部位軸突再生使神經(jīng)傳導(dǎo)束重新連接，或是通過提高殘存的神經(jīng)軸突的可塑性重組神經(jīng)環(huán)路。對于中樞神經(jīng)損傷修復(fù)機制的探討和研究日益增多，然而中樞神經(jīng)功能恢復(fù)是一個復(fù)雜的過程，涉及許多基因和蛋白的調(diào)控，近年來生長相關(guān)蛋白43（growth associated protein 43，GAP-43）已成為學(xué)者研究的焦點，關(guān)于GAP-43蛋白參與中樞神經(jīng)損傷修復(fù)的研究大量展開，同時對于調(diào)節(jié)和協(xié)同GAP-43蛋白發(fā)揮作用的其他信號分子的研究也日益深入。

GAP-43蛋白是一種膜相關(guān)磷蛋白，主要表達于發(fā)育或再生軸突的生長錐末端，主要參與軸突生長、突觸重構(gòu)以及兒茶酚胺和神經(jīng)肽類物質(zhì)的分泌[2]。GAP-43蛋白的表達貫穿于整個發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)的軸突生長全過程，隨著神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，GAP-43的表達逐漸下降并呈區(qū)域性受限。但是，在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中的很多部位可以出現(xiàn)伴隨軸突生長的GAP-43的上調(diào)表達[3]。在一些非哺乳類脊椎動物的視神經(jīng)受損后，隨著軸突再生可以出現(xiàn)GAP-43的增強合成，而哺乳類動物視神經(jīng)損傷后卻未能出現(xiàn)其上調(diào)表達，其原因在于受損軸突未能再生[4]。在成熟的哺乳動物的周圍神經(jīng)損傷后可以發(fā)現(xiàn)GAP-43的表達上調(diào)[5]，同時這種表達上調(diào)還可以在誘發(fā)大腦神經(jīng)元形成側(cè)支軸突發(fā)芽的過程中發(fā)現(xiàn)[6]。關(guān)于GAP-43蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中的具體作用機制眾說紛紜，但大都集中于軸突再生和軸突導(dǎo)向2個方面。

1 促進軸突再生

軸突再生是指特定條件下軸突的出芽、生長、延伸、與靶細胞重建軸突聯(lián)系實現(xiàn)神經(jīng)再支配而恢復(fù)功能的過程。與周圍神經(jīng)不同，成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突常不能有效再生，影響中樞神經(jīng)軸突有效再生的原因比較復(fù)雜，主要涉及神經(jīng)元內(nèi)在生長能力差、膠質(zhì)瘢痕的形成、缺乏生長促進分子及神經(jīng)再生抑制性因子的釋放等因素[7]。

盡管存在于成年哺乳動物大腦中的軸突生長會因局部的不利環(huán)境受到限制，但軸突再生的成功與否還取決于損傷神經(jīng)元本身固有的那些促神經(jīng)軸突生長延長的分子的表達能力[8]。在完整的成年動物神經(jīng)元中軸突生長相關(guān)基因序列受到抑制，而這種抑制更有可能來自非神經(jīng)元本身的外來因素所造成[9]。然而，在進行軸突切斷術(shù)的一些成年動物的神經(jīng)元卻可以上調(diào)表達與神經(jīng)軸突生長相關(guān)的基因，而且這種表達和再生軸突長入失神經(jīng)支配區(qū)的能力密切相關(guān)[10]。成年動物神經(jīng)元固有的軸突再生能力主要是指調(diào)節(jié)一系列特異性分子的表達，而這些分子均可定義為生長相關(guān)蛋白（growth associated proteins，GAPs）。在這些蛋白中最為典型的就是GAP-43蛋白，雖然這種蛋白在軸突生長過程中的準確作用尚存在諸多爭論，但GAP-43的表達的確與成年動物神經(jīng)元軸突再生及可塑性密切相關(guān)[11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小腦的浦肯野細胞十分特殊，原因在于其對軸突損傷后強大的抵抗能力，即便是在適宜軸突生長的環(huán)境下，仍表現(xiàn)十分弱的再生能力。Buffo等[11]通過實驗發(fā)現(xiàn)：GAP-43高度表達時可以修改浦肯野細胞對于軸突損傷的反應(yīng)，主要表現(xiàn)為降低其對損傷的抵抗，同時誘導(dǎo)軸突生長。Zhang等[12]實驗發(fā)現(xiàn)：GAP-43蛋白和細胞黏附分子L1在浦肯野細胞中協(xié)同表達時可以將那些不具備再生能力的中樞神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)榫邆湓偕芰?，而且這2種分子協(xié)同表達對體內(nèi)中樞神經(jīng)元固有的再生能力起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Houle等[13]發(fā)現(xiàn)：在頸椎水平進行軸突切斷術(shù)，紅核脊髓神經(jīng)元內(nèi)可短暫的出現(xiàn)GAP-43和Tal微管蛋白（Ta1-tubulin）的表達量增高，同時這種現(xiàn)象還對應(yīng)了1%～2%比例的軸突生長。陽性α－氨基-3-羥基-5-甲基-4-丙酸 （alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）受體調(diào)節(jié)劑可以減少由于興奮毒性腦損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)元喪失[14]，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）神經(jīng)元的連接和其存活有十分重要的作用[15]，Gupta等[16]通過實驗證明：陽性AMPA受體調(diào)節(jié)劑和BDNF在促神經(jīng)生長和軸突側(cè)枝發(fā)芽方面的作用均需要GAP-43蛋白的參與，GAP-43蛋白在AMPA受體調(diào)節(jié)劑和BDNF發(fā)揮神經(jīng)元保護和可塑性方面作用過程中是一種共同的中介物，并推測GAP-43蛋白可以作為在神經(jīng)退變性疾病中調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞凋亡以及促進其可塑性的新的治療靶點。軸突分支、出芽及再生是一個有序發(fā)生的過程，這期間包括細胞內(nèi)外各種信號蛋白的表達，這些信號蛋白可以重構(gòu)細胞骨架進而調(diào)節(jié)軸突和生長錐的可塑性。在轉(zhuǎn)錄水平，這些信號蛋白受一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子包括 c-jun、C/EBP、CREB、STAT3及p53等[17－18]。Tedeschi等[19]發(fā)現(xiàn)：p53參與了周圍神經(jīng)損傷后軸突分支和再生過程，而且某種程度上是通過調(diào)控細胞骨架相關(guān)蛋Coronin-1b和G蛋白家族成員之一的Rab13蛋白的表達來完成的。更重要的是，在觀察軸突分支的體外細胞培養(yǎng)實驗和觀察脊髓損傷后軸突發(fā)芽的體內(nèi)實驗中，均發(fā)現(xiàn)GAP-43蛋白與Coronin 1b和Rab13協(xié)作表 達[20－21]，Tedeschi等[19]提 出：CBP/p300-p53-GAP-43轉(zhuǎn)錄模塊在退變性神經(jīng)疾病中為軸突生長和再生提供了一個新的分子靶點。最近的研究揭示：軸突生長中存在大量細胞黏附分子（CAMs）的信號瀑布反應(yīng)，然而這種由CAMs誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突側(cè)枝發(fā)芽和突觸可塑性的信號瀑布反應(yīng)的具體機制尚不清楚。Meiri等[22]發(fā)現(xiàn)：激活神經(jīng)細胞黏附分子（NCAM）調(diào)節(jié)的纖維母細胞生長因子（FGF）受體可以促進小腦顆粒細胞內(nèi)的軸突生長，但這一過程依靠GAP-43蛋白在絲氨酸-41的磷酸活化才能完成，這種生長錐內(nèi)GAP-43的磷酸化需在花生四烯酸內(nèi)的FGF受體依賴性增強的前提下才能完成。Korshunova等[23]在GAP-43基因敲除小鼠的小腦顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)NCAM不能刺激軸突分支生長；同樣，在C3C4突變的GAP-43不能像原株GAP-43那樣依附于質(zhì)膜，所以對NCAM的刺激也沒有反應(yīng)，因此GAP-43與質(zhì)膜的結(jié)合可能對NCAM誘導(dǎo)的神經(jīng)軸突的產(chǎn)生意義重大。

2 軸突導(dǎo)向作用

分布于軸突以外，在神經(jīng)發(fā)育過程中引導(dǎo)軸突沿正確途徑生長到達靶區(qū)的分子，稱為軸突導(dǎo)向分子。以往的研究也大多集中在這些分子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用。近年來，這些分子在成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的表達及作用的研究增多[24]。

無效突變的生長相關(guān)蛋白GAP-43作為一種蛋白激酶C（PKC）的酶作用物在發(fā)育階段的軸突生長過程中起到關(guān)鍵作用[25]。Aigner等[26]報道：高表達雞 GAP-43蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠可以誘導(dǎo)異常的苔狀纖維（MFs）超越正常的軸突末端區(qū)域即透明層（SL）而長入始層（SO）。然而這一現(xiàn)象并未在原株型C57BL6鼠中發(fā)現(xiàn)[27－28]，這可能是由于大部分椎體細胞苔狀纖維的生長路徑被其生長目標(biāo)區(qū)域SL特異性終止而未能長入SO。GAP-43作為PKC的作用底物之一，可以調(diào)節(jié)生長錐內(nèi)的F－肌動蛋白活性[29]。PKC磷酸化的GAP-43主要位于具有活性的板層和絲狀偽足，并且在體外實驗中通過重構(gòu)聚合－解聚循環(huán)來穩(wěn)定肌動蛋白纖維；相反，未磷酸化的GAP-43富含于萎縮或崩解的板層并且抑制F-肌動蛋白的聚合。生長錐中GAP-43可以通過免疫球蛋白（Ig）家族細胞黏附分子（IgSF-CAMs）刺激而被PKC磷酸化，進而參與神經(jīng)接合處的軸突導(dǎo)向過程[22]。Shen等[30]通過實驗發(fā)現(xiàn)：在GAP-43基因敲除鼠不能在大腦的前聯(lián)合、海馬以及胼胝體處形成有效神經(jīng)連接，而且盡管中線處的融合是正常的，但在連接處的軸突的選擇性自發(fā)收縮卻受到抑制，軸突生長混亂，而且生長錐中的F－肌動蛋白水平明顯下降。在軸突分支生長和再生的過程中，生長錐肩負引導(dǎo)軸突延長并長入正確的目標(biāo)位置的責(zé)任。生長錐周圍環(huán)境中的細胞表面的導(dǎo)向信號與絲狀偽足的受體接合觸發(fā)生長錐局部區(qū)域的第二信使系統(tǒng)，進而使細胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[31]。一些研究[32]報告指出：絲狀偽足擔(dān)當(dāng)一種類似自發(fā)性傳感器作用向生長錐傳遞信息，從而對信號檢測起到關(guān)鍵作用。神經(jīng)生長的開始階段常伴隨一些GAPs的高度表達。調(diào)整GAP-43的表達水平能夠?qū)毎蜕L錐形態(tài)學(xué)方面起到很大的作用。非神經(jīng)元細胞表達GAP-43會引起細胞自發(fā)性絲狀偽足的形成[33]。神經(jīng)元細胞中過度表達GAP-43不僅能誘發(fā)絲狀偽足的形成[34]，而且可以提高軸突分支生長的能力。Maier等[25]認為：GAP-43是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突導(dǎo)向的重要蛋白，通過實驗發(fā)現(xiàn)缺少GAP-43表達的大鼠不能在嚙齒類動物第一軀體感覺皮質(zhì)的layerⅣ區(qū)建立正常的胡須式桶裝結(jié)構(gòu)，丘腦皮質(zhì)以不規(guī)則的路徑投射至layerⅣ區(qū)，并錯誤地定位于皮質(zhì)，表明GAP-43的表達對于建立正常的皮質(zhì)桶狀形態(tài)是十分關(guān)鍵的。有研究[35]顯示：鼠胚胎期缺乏GAP-43將影響視神經(jīng)束的形成[36]，其原因在于缺乏GAP-43可能導(dǎo)致早期的RGC軸突不能通過視交叉進入視神經(jīng)束。細胞質(zhì)中的Ca2＋參與許多導(dǎo)向信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其中包括對于生長錐運動的調(diào)節(jié)信號[37]，而這種作用主要基于對細胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[38－39]以及對膜前導(dǎo)囊泡的運輸作用。Caprini等[40]實驗發(fā)現(xiàn)：低滲透活性的GAP-43可以誘導(dǎo)Ca2＋從IP3-sensitive的細胞內(nèi)釋放。同時作者認為：GAP-43滲透敏感性可以將軸突的延伸與磷酸肌醇的代謝聯(lián)系起來，從而引起Ca2＋濃度的轉(zhuǎn)變以調(diào)節(jié)肌動蛋白的運動性，并以此建立一種對于生長錐生長及延伸的機械理論框架。

3 小 結(jié)

對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生和神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)的研究日益增多，但對其具體的完整機制卻中說紛紜，GAP-43作為調(diào)節(jié)生長錐出芽生長和軸突導(dǎo)向的重要蛋白，已成為未來研究神經(jīng)再生和軸突可塑性機制的關(guān)鍵蛋白之一，但軸突的再生以及正確的長入目標(biāo)區(qū)域的過程需要一系列信號分子的參與，GAP-43還需要通過這些信號分子的協(xié)同調(diào)節(jié)才能有效地發(fā)揮作用。

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