水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗細根生長及根抗氧化酶的影響

劉洋，張啟昌，張璐，李玉靈

（1.河北農(nóng)業(yè)大學林學院，河北 保定 071001；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院農(nóng)學院，吉林 吉林 132101；3.北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

藍靛果忍冬（Lonicera caerulea）是兼有食用價值、經(jīng)濟價值、醫(yī)用價值的漿果類落葉灌木，果實含有氨基酸、黃酮、維生素、酚醛類物質(zhì)等,具有抗氧化、清熱解毒的功效，已經(jīng)成為新一代小漿果樹種，深受人們的喜愛[1-4]。

細根可以反映植物對土壤水分和養(yǎng)分的適應狀況[5]，對整株植物的生長具有重要影響。良好的根系發(fā)育可以縮短緩苗時間，使植株提早進入快速生長期[6]。在土壤水肥極度缺少或過量時，根系生理特性也會出現(xiàn)相應變化以維持植物正常生長[7-8]。植物處在逆境環(huán)境下，會產(chǎn)生自由基等有害物質(zhì)，自由基會破壞細胞質(zhì)膜，使相對電導率升高，這時植物體內(nèi)保護酶系統(tǒng)開始啟動，清除過剩自由基等有害物質(zhì)從而維持植物正常生長。研究植物體內(nèi)抗氧化酶活性可以判斷植物抵抗逆境的能力[9-10]。林興軍[11]對番茄體內(nèi)抗氧化酶的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會引起超氧化物歧化酶（soperoxide dismutase，SOD）、過 氧 化 物 酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶活性升高，施肥對番茄葉片SOD和CAT均產(chǎn)生顯著影響，干旱脅迫下增加施肥量可以使酶的活性降低。根系直接吸收水分和養(yǎng)分，受水肥的影響最敏感，當受外界環(huán)境脅迫時，細胞內(nèi)大量自由基的累積導致細胞的膜脂過氧化，根系會做出積極響應，應對環(huán)境的變化[12]。張希吏等[13]研究了干旱脅迫對沙芥幼苗根系抗氧化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)POD活性、CAT活性、抗壞血酸活性會隨著脅迫的加劇而升高，SOD活性則出現(xiàn)了先上升后下降的變化趨勢，說明幼苗根系在干旱脅迫下受到了一定程度的傷害。里程輝等[14]研究淹水脅迫下不同中間砧對蘋果岳冠根系抗氧化酶活性的影響，表明根系中SOD、POD、CAT、APX活性均先上升后下降，脅迫初期雖然誘導了酶保護系統(tǒng)，減輕自由基對根系細胞的傷害，但是隨著脅迫程度的加劇，超過了植物的承受能力，抗氧化酶活性降低。水肥耦合對植物細根生長和根系抗氧化酶的影響研究多集中在蔬菜和作物栽培中，在小漿果類樹種中研究較少。近幾年對藍靛果忍冬生理特性的研究也受到廣泛關注，從目前研究來看，對其生理特性影響的研究主要集中在低溫、水分、養(yǎng)分、鹽分脅迫的研究[15-19]。水肥是影響藍靛果忍冬幼苗生長的重要環(huán)境因子，目前藍靛果忍冬幼苗根系水肥耦合效應研究較少，對細根生長及根系抗氧化酶的影響研究未見報道。因此，通過對藍靛果忍冬細根生長和根系抗氧化酶系統(tǒng)對水肥耦合的響應進行研究，認識藍靛果忍冬細根生長和根系生理特性與土壤環(huán)境的作用機理和響應規(guī)律，以期為藍靛果忍冬苗期立地篩選、水肥精準管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗在吉林省吉林市北華大學東校區(qū)進行。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風氣候，四季分明。年無霜期120~130 d，年日照時數(shù)2 400~2 600 h，年平均氣溫4℃，最熱月（7月）月平均氣溫21℃，最冷月（1月）月平均氣溫1℃。年平均降水量450~670 mm，80%降雨量集中在夏季。

基質(zhì)為農(nóng)田土，有機質(zhì)含量為15.23 g·kg-1，全氮（N）含量2.87 g·kg-1，全磷（P）含量1.08 g·kg-1，全鉀（K）含量25.88 g·kg-1，速效N含量132.68 mg·kg-1，速 效P含 量38.69 mg·kg-1，速 效K含 量288.69 mg·kg-1，pH 6.24。測定培養(yǎng)土田間最大持水量（field capacity，F(xiàn)C）為28.29%。

1.2 試驗材料

試驗材料為藍靛果忍冬“北華1號”1年生扦插苗，選擇根系生長一致的幼苗。試驗采用盆栽試驗，每盆栽植1株，共20個處理，每個處理8盆，共160株。試驗用花盆規(guī)格為30 cm（上口內(nèi)徑）×25 cm（高），上盆前用3%硫酸亞鐵對土壤進行消毒處理。緩苗期25 d，至4月30日緩苗結束，緩苗期間進行正常養(yǎng)護管理。

1.3 試驗設計

試驗采用三因素五水平二次旋轉回歸組合設計，試驗因素分別為土壤水分（W）、氮肥施入量（N）和磷肥施入量（P）。各試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素水平編碼Table 1 Level coding of experimental factors

土壤水分：35%FC為重度干旱脅迫，45%FC為中度干旱脅迫，60%FC為輕度干旱脅迫，75%FC為適合水分條件，85%FC為過量灌溉。根據(jù)1年生藍靛果忍冬幼苗收獲時含氮量、含磷量結合常規(guī)生產(chǎn)施肥量，確定了施氮量和施磷量。施鉀量為常規(guī)生產(chǎn)施肥量。20種處理實際值見表2。

表2 不同處理土壤水分、施氮量、施磷量實際值Table 2 Soil moisture，nitrogen application and phosphorus application under different treatments

1.4 試驗因子控制方案

氮肥用尿素（CH4N2O，含N為46%，山西陽煤豐喜肥業(yè)），磷肥用分析純過磷酸鈣（(CaH2PO4)2·CaSO4·H2O，含P為16%），鉀肥用分析純硫酸鉀（K2SO4，含K為50%）。氮肥共分3次施入（5月26日、6月20日、7月15日），磷肥根據(jù)計算量于5月26日一次性施入，鉀肥（3 g·株-1）定量于5月26日一次性施入。施肥方式：分別在幼苗周圍4個方位距根莖5 cm處挖穴埋施，每穴施肥量相等，施肥于澆水當日進行。

土壤水分控制采用整盆稱重法結合便攜式土壤濕度、溫度和鹽度計（FOM/mts）進行校訂。緩苗期結束后進行控水試驗，控水時間為4月30日至9月30日，每2 d于傍晚補水1次。每個處理任意挑選不連續(xù)擺放的3盆進行稱重，稱重時輕拿輕放于2 min內(nèi)完成，補水采用1 000 mL量筒（精確度10 mL）。根據(jù)隨機挑選的3盆幼苗灌水量的平均值確定該處理其他苗盆的灌水量。

1.5 測定指標

1.5.1 細根生長指標測定 按照Pregitzer等[20]的方法對根樣進行根系分級（圖1）。分級后，將各級根用Epson數(shù)字化掃描儀掃描，將掃描后的圖像存入計算機，用于掃描儀配套的WinRHIZO(Pro2004b)根系圖像分析系統(tǒng)軟件對各級根系形態(tài)進行定量分析。掃描后的各級根系分別裝入信封，在105℃烘箱中殺青1 h，然后再置于65~70℃烘箱中烘干至恒重，用天平對其稱重，記錄的數(shù)據(jù)即為生物量干質(zhì)量。

圖1 根序分級示意圖［20］Fig.1 Schematic diagrams of root identification［20］

根據(jù)根系圖像分析系統(tǒng)軟件可以直接測量和計算細根的根長。比根長按照下列公式計算。

1.5.2 根系抗氧化酶指標測定 依照蔡慶生[21]的測定方法對藍靛果忍冬幼苗根系SOD、POD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）進行測定；參照Nakano等[22]的方法測定APX活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 25.0和SAS9.0進行ANOVA方差分析、回歸模型建立和回歸系數(shù)檢驗，利用Sigmaplot 12.0繪圖，利用Lingo18.0進行多目標決策模型分析。本研究中各指標與土壤水分、施氮量、施磷量回歸分析采用以下模型。

式中，y表示響應變量，x1表示土壤水分（W），x2表示施氮量（N），x3表示施磷量（P），k表示模型的回歸系數(shù)。試驗中，各響應變量的回歸系數(shù)已標準化，各影響因素的水平已經(jīng)過無量綱線性編碼代換。其系數(shù)正負號表示各因素對變量的影響方向，直接比較其系數(shù)絕對值可以判斷各因素對響應變量的影響程度。

2 結果與分析

2.1 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗細根根長的影響

藍靛果忍冬幼苗一共有5級根，根據(jù)根序法進行根系分級，把藍靛果忍冬幼苗的1~3級根定為細根。對藍靛果忍冬幼苗細根根長進行測定，結果如圖2，不同處理1~3級根根長變化范圍分別為122.24~338.69、75.99~159.65、28.44~86.21 cm。處理8明顯高于其他處理，1級根根長是處理3的2.77倍；2級根根長是處理2的2.11倍，3級根根長是處理4的3.03倍，均達到顯著差異（P＜0.05），說明適當?shù)乃侍幚碛欣谒{靛果忍冬細根長度的增加。

圖2 藍靛果忍冬1~3級根根長Fig.2 Length for the 1~3 order roots in Lonicera caerulea

2.2 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗細根比根長的影響

如圖3所示，不同處理藍靛果忍冬幼苗1~3級根的比根長變化范圍分別是76.93~225.26、21.48~53.22、4.03~16.24 m·g-1，說明不同水肥處理對藍靛果忍冬幼苗細根的比根長有明顯影響。其中，處理8的1級、2級、3級根比根長顯著高于其他處理（P＜0.05），分別是比根長較低的處理9的2.93、1.79、3.57倍，是處理11的2.39、2.42、3.37倍。說明適當?shù)乃逝涫┠苊黠@增加藍靛果忍冬細根的比根長，有利于根對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

圖3 藍靛果忍冬1~3級根比根長Fig.3 Specific root length for the 1~3 order roots in Lonicera caerulea

2.3 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗根系SOD活性的影響

如圖4所示，不同處理藍靛果忍冬幼苗根系SOD活性變化范圍在7.62~32.99 U·g-1·min-1，處理4的SOD活性最高且與其他處理差異顯著（P＜0.05），處理1和處理9的SOD活性也較高。處理7、處理8和處理15~20的SOD活性較低。處理4是處理15~20的3.6~4.3倍，SOD活性在輕度脅迫下較穩(wěn)定，當水肥脅迫程度加劇時，SOD活性升高，當達到重度脅迫時，SOD活性又降低。說明水肥配施有利于維持藍靛果忍冬根系SOD活性的穩(wěn)定，水肥不足會引起抗氧化酶活性升高。

圖4 不同處理藍靛果忍冬根系超氧化物歧化酶活性的變化Fig.4 Changes of SODactivity in the roots of Loniceracaerulea under different treatments

2.4 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗根系POD活性的影響

如圖5所示，不同處理藍靛果忍冬幼苗根系POD活性變化范圍在10.44~39.26 U·g-1·min-1。處理3、4、13、14的POD活性較高；處理5、7、15~20和處理8的POD活性較低。其中，處理13的POD活性是處理15~20的2.6~3.8倍，且達到顯著差異（P＜0.05），在土壤水分和施氮量充足的條件下以及土壤水肥輕度脅迫下POD活性較穩(wěn)定，當中度干旱脅迫時，POD活性升高，當磷肥施入不足或過量時也會引起POD活性升高，進一步說明水肥配施有利于維持藍靛果忍冬根系POD活性的穩(wěn)定，水肥不足或過量灌溉施肥影響了POD活性的穩(wěn)定。

圖5 不同處理藍靛果忍冬根系過氧化物酶活性的變化Fig.5 Changes of PODactivity in the roots of Loniceracaerulea under different treatments

2.5 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗根系APX活性的影響

如圖6所示，不同處理藍靛果忍冬幼苗根系APX活性變化范圍在44.00~194.00 U·g-1·min-1。處理15~20、處理5~8和處理10的APX活性較低；處理2、3、9、11和處理13的APX的活性較高。根系APX的活性對土壤水肥較為敏感，當土壤水肥條件合適時，根系APX活性穩(wěn)定，當中度干旱脅迫和重度干旱脅迫時均引起APX活性升高，未施磷肥的處理13和未施氮肥的處理11的APX活性也較高。另外，處理4為中度干旱脅迫但氮磷施入適量，雖然APX活性升高，但由于氮磷的合理施入有效緩解了干旱脅迫。

圖6 不同處理藍靛果忍冬根系抗壞血酸過氧化物酶活性的變化Fig.6 Changesof APX activity in the roots of Loniceracaerulea under different treatments

2.6 水肥耦合對藍靛果忍冬幼苗根系GSH-Px活性的影響

從圖7可以看出，不同處理藍靛果忍冬幼苗根系GSH-Px活性變化范圍在1.43~4.09 U·g-1·min-1。處理1的GSH-Px活性最高，且與其他處理達到了顯著差異（P＜0.05），處理11和處理6的GSH-Px活性也較高；處理10、15~20的GSH-Px活性較低。水肥脅迫影響了GSH-Px活性，適水適肥條件下藍靛果忍冬幼苗根系GSH-Px活性穩(wěn)定。處理1與3達到顯著差異（P＜0.05），二者只是施氮量不同，處理6和處理8達到顯著差異（P＜0.05），二者也是施氮量不同，說明施氮量對GSH-Px活性有顯著影響。

圖7 不同處理藍靛果忍冬根系谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化Fig.7 Changes of GSH-Px activity in the roots of Loniceracaerulea under different treatments

2.7 水肥因子效應分析

2.7.1 藍靛果忍冬幼苗細根根長 分別以藍靛果忍冬幼苗1~3級根根長y1~y3為響應變量，土壤水分（x1）、施氮量（x2）、施磷量（x3）為自變量，對回歸模型進行檢驗分析，3個回歸模型均達到了顯著性水平（P＜0.05），說明模型與實際情況擬合較好，響應變量與土壤的水分、施氮量、施磷量有較強的相關性（R2范圍在0.556~0.732）。在剔除不顯著因素后，各響應變量與土壤水肥的模型如下。

模型4中，x1和x3的回歸系數(shù)均為正值，且|x1|＞|x3|，說明土壤水分、施磷量正向作用于1級根根長，其中土壤水分是主效應。耦合效應方面，土壤水分和施氮量、施氮量和施磷量對1級根根長有顯著耦合正效應。模型5中，x1和x2的回歸系數(shù)均為正值，且|x1|＞|x2|，說明土壤水分和施氮量正向作用于2級根根長，主效應為土壤水分，耦合效應分析，施氮量和施磷量對2級根根長有顯著耦合正效應。模型6中，x1和x2回歸系數(shù)均為正數(shù)，且|x1|＞|x2|，說明土壤水分為主效應，耦合效應分析施氮量和施磷量對3級根根長有顯著耦合正效應。綜合分析模型4~6，土壤水分、施氮量、施磷量均對藍靛果忍冬細根根長有顯著影響，其中土壤水分是主要影響因子，耦合效應分析施氮量和施磷量對細根根長耦合效應最顯著。

2.7.2 藍靛果忍冬幼苗細根比根長 分別以藍靛果忍冬幼苗1~3級根比根長y1~y3為響應變量，土壤水分（x1）、施氮量（x2）、施磷量（x3）為自變量，對回歸模型進行檢驗分析，3個回歸模型均達到了顯著性水平（P＜0.05），說明模型與實際情況擬合較好，響應變量與土壤水分、施氮量、施磷量有較強的相關性（R2范圍為0.435~0.726）。在剔除不顯著因素后，各響應變量與土壤水肥的回歸模型如下。

模型7~9中，綜合分析x1、x2、x3、x1x2、x1x3、x2x3的回歸系數(shù)，土壤水分、施氮量、施磷量均正向作用于細根比根長，土壤水分為主效應。耦合效應方面，土壤水分和施氮量耦合效應對細根比根長有顯著耦合正效應。

2.7.3 藍靛果忍冬幼苗根系抗氧化酶 分別以藍靛果忍冬幼苗根系超氧化物酶活性（ySOD）、過氧化物酶活性（yPOD）、抗壞血酸過氧化物酶活性（yAPX）、谷胱甘肽過氧化物酶活性（yGSH-Px）為響應變量，土壤水分（x1）、施氮量（x2）、施磷量（x3）為自變量，對回歸模型進行檢驗分析，4個回歸模型均達到了顯著性水平（P＜0.01），說明模型與實際情況擬合較好，響應變量與土壤的水分、施氮量、施磷量有較強的相關性（R2范圍為0.712~0.871）。在剔除不顯著因素后，各響應變量與土壤水肥的回歸模型如下。

根據(jù)回歸模型10~13，總結了土壤水肥因子對根系抗氧化酶活性的影響（表3）。各測定指標對水肥耦合的響應略有差別，土壤水分、施磷量對藍靛果忍冬幼苗根系抗氧化酶活性均有顯著負效應，其中施磷量對POD影響最顯著，施氮量對SOD、APX、GSH-Px影響最顯著。耦合效應方面，施氮量和施磷量耦合效應對所測定的抗氧化酶活性影響最顯著。

表3 藍靛果忍冬幼苗根系抗氧化酶活性土壤水肥因子效應綜合分析Table 3 Effects analysis of soil and fertilizer application on antioxidant enzyme activity of root of Lonicera caerulea seedlings

2.8 對模型進行尋優(yōu)

通過模型優(yōu)化計算及綜合分析結果得出，藍靛果忍冬幼苗細根生長和維持根系抗氧化酶活性穩(wěn)定的最優(yōu)水肥組合為：土壤田間最大持水量的69%，施氮量為3.3 g·株-1，施磷量為1.2 g·株-1，在此處理下藍靛果忍冬幼苗細根總根長為521.46 cm、細根總比根長為300.51 m·g-1；藍靛果忍冬根系SOD活性、POD活性、APX活性、GSH-Px活 性 分 別 為13.84、15.41、67.56、1.73 U·g-1·min-1。

3 討論

藍靛果忍冬幼苗細根各生長指標對土壤水肥因子的響應規(guī)律相似，合理的水肥施入量及其耦合效應有利于促進藍靛果忍冬幼苗細根生長。其中，處理8幼苗細根生長最好，這與程奇云[23]的研究施肥會顯著影響果樹根系生長且有助于苗木生長的研究結論一致。本研究表明，在適水適氮適磷處理下，藍靛果忍冬幼苗細根根長和比根長明顯高于低水處理、無氮處理和無磷處理。藍靛果忍冬幼苗細根在生長期對土壤水分敏感，其水氮耦合、水磷耦合、氮磷耦合對細根根長和比根長有顯著正效應，氮磷耦合對細根根長影響最顯著，而水氮耦合對細根比根長影響最顯著。

植物體內(nèi)抗氧化酶的含量變化是表征植物逆境下應對脅迫的重要指標。植物處在脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧增多會產(chǎn)生傷害植物生長的氧化產(chǎn)物，這些氧化產(chǎn)物會破壞植物細胞質(zhì)膜完整性，導致細胞損傷，從而影響植物生長[24-26]。為保護植物正常生長，在植物遭受脅迫時，植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列的抗氧化酶來清除自由基[27]。本研究表明，水肥適合的處理7、處理8和輕度脅迫處理15~20藍靛果忍冬幼苗根系抗氧化酶活性較低，處理1~4（中度干旱脅迫）、處理9（重度干旱脅迫）、處理11（無氮）和處理13（無磷）藍靛果忍冬根系中抗氧化酶活性均升高，這與鄒養(yǎng)軍[28]的研究蘋果長時間處在缺水條件下根系SOD、POD的活性會明顯增高的結果基本一致，與侯棟等[29]以2年生香玲等4個核桃品種為試材不同干旱脅迫處理對其POD活性的影響結果也基本一致。在主效應和耦合效應分析中，施氮量為主效應，施磷量和施氮量耦合效應對幼苗根系抗氧化酶影響最為顯著。以上表明合理施肥更有利于維持抗氧化酶活性的穩(wěn)定性，過度灌溉、施肥或水肥缺失下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基使其正常代謝受到干擾，細胞處于逆境時植物通過升高抗氧化酶活性以清除這些氧化物，使細胞質(zhì)膜所受傷害降低，植物體內(nèi)過氧化酶升高說明細胞環(huán)境穩(wěn)定性受到了破壞。需要注意的是，處理15~20抗氧化酶活性較低，輕度脅迫下抗氧化酶活性并未升高，說明在輕度逆境下藍靛果忍冬幼苗根系抗氧化酶系統(tǒng)未啟動，藍靛果忍冬對于逆境有一定的抵抗能力，但隨著水分和養(yǎng)分脅迫的加劇，抗氧化酶系統(tǒng)啟動，抗氧化酶活性升高，而當超過了閾值時，如處理9和處理11，抗氧化酶活性又降低，說明抗氧化酶系統(tǒng)遭到了嚴重破壞，嚴重影響了植物的正常生長。另外，在研究中還發(fā)現(xiàn)不同的酶在不同水肥條件下活性有差別，GSH-Px活性在施氮量不足時活性最高、POD活性在施磷量不足時活性最高，說明不同水肥條件下不同的酶的主導地位不一樣，此消彼長、協(xié)同作用于植物體以維持細胞正常的代謝平衡保護質(zhì)膜結構不被破壞。