6 個建鯉家系的遺傳結構及不同親緣關系個體間的遺傳差異分析

李建林，唐永凱，李紅霞，俞菊華，董在杰

(中國水產科學研究院 淡水漁業(yè)研究中心農業(yè)部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫214081)

建鯉Cyprinus carpio var.jian是以荷包紅鯉和元江鯉為親本，通過家系選育、多系雜交、雌核發(fā)育和橫交固定等育種技術相結合而培育成的魚類新品種［1］。該品種具有生長快、肉質好、抗逆性強、易起捕等經濟性狀［2］，雖然建鯉遺傳性狀比較穩(wěn)定，但要保持或更進一步提高其經濟性狀，仍需要對建鯉不斷地進行選育保種和遺傳保護。

分子標記直接反映的是親本間基因組水平上的遺傳差異，能夠在一定程度上預測后代優(yōu)勢的產生。目前對鯉功能基因組學及其遺傳連鎖圖譜的研究較為深入［3］，分子標記輔助選育技術也已逐步應用于鯉育種中。微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性頻率高、共顯性的孟德爾式遺傳等優(yōu)點，是實現(xiàn)家系間和個體間的遺傳差異、親緣關系分析等較為理想的分子標記［4］，如在大菱鲆［5］、真鯛［6］、大西洋比目魚［7］、牙鲆［8］、虹鱒［9］、馬氏珠母貝［10］等水產生物中都有相關報道。為進一步提高建鯉的生長速度和遺傳穩(wěn)定性，2011年本課題組運用與建鯉生長相關的SNP 標記［11］構建了30 個家系進行了育種試驗，本研究中，作者采用微衛(wèi)星標記技術分析了其中6 個家系的遺傳結構及不同親緣關系個體間的遺傳差異，旨在為應用微衛(wèi)星標記輔助構建建鯉家系和保種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚取自于中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，從30 個建鯉家系中隨機取6 個家系，編號為3#、5#、7#、8#、9#、10#。剪取各家系親本以及各家系子代共30 尾個體的鰭條，用體積分數(shù)為95%的酒精保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 樣本鰭條經蛋白酶K 消化后，用保和酚、氯仿抽提總DNA［12］，用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA 基因組的完整性，再用紫外分光光度計測定DNA 樣品的濃度和純度，稀釋DNA 至50 ～100 ng/μL，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。從每個家系中隨機取12 尾子代及其親本的DNA 樣品用于試驗分析。

1.2.2 引物合成及PCR 反應 微衛(wèi)星引物為中國水產科學研究院黑龍江水產研究所開發(fā)的鏡鯉微衛(wèi)星標記引物［13-14］，由上海博尚生物技術有限公司合成。表1 列出了經篩選得到的12 對在建鯉中能擴增出清晰條帶的引物序列和退火溫度。PCR 反應總體積為10 μL，其中含10×buffer 1.0 μL，2 mmol/L MgCl21.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，10 μmol/L 引物0.1 μL，5 U/μL Taq 酶0.1 μL，50 ～100 ng/μL DNA 1.0 μL。PCR 反應條件為:94℃下預變性3 min;94 ℃下變性20 s，退火20 s，72 ℃下延伸20 s，共進行30 個循環(huán);最后在72 ℃下延伸8 min，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電泳及染色 PCR 產物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳結束后，用硝酸銀染色后拍照記錄電泳結果。根據(jù)25 bp DNA Step Ladder(Promega)分子量標記和PCR 擴增片段大小，分析各位點的等位基因，并確定基因型。

表1 12 對微衛(wèi)星引物序列及其反應條件Tab.1 The sequences and PCR reaction conditions of 12 primer pairs

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)每個個體的PCR 擴增條帶建立基因型數(shù)據(jù)矩陣，用Cervus 3.0和GenAlEx 6.2 軟件分析每一位點的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)和遺傳分化系數(shù)(Fst)等參數(shù);用Populations 軟件計算群體和個體間的DA遺傳距離［15］;使用SPSS 統(tǒng)計軟件對不同親緣關系個體間的遺傳距離進行單因素方差分析;根據(jù)遺傳距離用Mgea 5.1 軟件按非加權配對算術平均法(UPGMA)對不同家系建立聚類圖。

2 結果與分析

2.1 12 個微衛(wèi)星位點的擴增結果及多態(tài)性

本試驗中所選出的12 對微衛(wèi)星引物在建鯉群體中均能擴增出清晰的條帶，并且重復性好，PCR產物通過8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以清楚地分辨基因型，圖1 為位點HLJ1316(a)、HLJ1410(b)和HLJ1458(c)的部分電泳結果。經統(tǒng)計分析，各位點在6 個建鯉家系中共檢測出80 個等位基因，每個位點檢測到的等位基因為3 ～10 個，平均為6.7 個;共檢測出基因型172種，每個位點檢測到的基因型為5 ～24種，平均為14.3種。12 個位點中HLJ1458 的多態(tài)性最高，檢測到10 個等位基因和24種基因型。

2.2 6 個家系的遺傳多樣性及遺傳分化

2.2.1 遺傳多樣性 12 個微衛(wèi)星位點中，只有位點HLJ1211在5#家系以及位點HLJ1410在10#家系表現(xiàn)為單態(tài)性，其他均為多態(tài)性。從表2可見:12個微衛(wèi)星位點分別在6 個建鯉家系中平均檢測到等位基 因 2.9 ～3.3 個;平 均 Ho和He 分 別為0.725 ～0.883和0.533 ～0.656;平均PIC 為0.440 ～0.584;3#家系各遺傳多樣性參數(shù)均為最高;6 個建鯉家系平均固定系數(shù)(FIS)為-0.422～-0.318，都表現(xiàn)為雜合子過剩(FIS＜0)。

2.2.2 家系間的遺傳分化 從表3可見:各家系間的遺傳距離為0.312 9 ～0.578 9，平均為0.458 7，3#家系與10#家系間的遺傳距離最小，5#家系與8#家系間的遺傳距離最大。UPGMA 聚類分析結果表明(圖2)，3#家系與10#家系以及8#與9#家系親緣關系比較近，聚類在同一小分支上，其他家系親緣關系相對較遠。AMOVA 分析結果表明，6 個家系的Fst為0.115 ～0.390，平均 為0.209 4，說明有21%的遺傳變異來源于家系間，79%來源于家系內。6 個建鯉家系中，12 個位點的基因流(Nm)為0.368 ～1.404，平均為0.962 3，其中5 個位點的Nm大于1，7 個位點的Nm小于1。

圖1 位點HLJ1316(a)、HLJ1410(b)、HLJ1458(c)的部分擴增結果Fig.1 Partial results amplified by HLJ1316(a)，HLJ1410(b)and HLJ1458(c)

表2 12 個微衛(wèi)星位點在6 個建鯉家系中的平均遺傳信息Tab.2 Average genetic information of the 12 microsatellite loci in 6 common carp Cyprinus carpio var.jian families

圖2 6 個建鯉家系UPGMA 聚類分析結果Fig.2 UPGMA dendrogram among 6 common carp Cyprinus carpio var.jian families

表3 6 個建鯉家系間的遺傳距離Tab.3 Genetic distance of 6 common carp C.carpio var.jian families

2.3 不同親緣關系個體間的遺傳差異

經Populations 軟件計算得到84×84 所有個體間的遺傳距離矩陣，在不分家系的情況下，個體間的遺傳距離為0.108 ～0.875，平均為0.587 2;按不同親緣關系進行分析結果表明:父本與子代的遺傳距離為0.257 0 ～0.448 2，平均為0.333 1;母本與子代的遺傳距離為0.240 ～0.507，平均為0.347 7;同胞子代間的遺傳距離為0.108 ～0.591，平均為0.318 0;不同家系沒有血緣關系個體間的遺傳距離為0.358 ～0.875，平均為0.635 3。父子間、母子間和同胞子代間的遺傳距離相近，但無顯著性差異(P＞0.05)，不同家系沒有血緣關系個體間的遺傳距離要大于親子間和同胞子代間的遺傳距離，且差異極顯著(P＜0.01)。表4 列出了各家系不同親緣關系個體間的平均遺傳距離。

表4 不同親緣關系個體間的平均遺傳距離Tab.4 Average genetic distance between the individuals with different genetic relationship

3 討論

3.1 6 個建鯉家系的遺傳多樣性

通過對不同家系的遺傳多樣性分析，可了解各家系的遺傳潛力和選育空間。本試驗中所篩選到的12 個微衛(wèi)星標記在6 個建鯉家系中平均檢測到6.7個等位基因和14.3種基因型，具有較高的多態(tài)性，能很好地用于建鯉群體的遺傳多樣性評估。雜合度和多態(tài)信息含量都是度量種群遺傳多樣性程度的重要參數(shù)，其含量越大群體遺傳結構變異越大，對環(huán)境適應能力就越強［16］。Dewoody等［17］利用微衛(wèi)星標記分析得出13種淡水魚類的平均Ho 為0.46。本試驗中建鯉各家系的平均Ho 為0.725 ～0.883，說明這6 個建鯉家系的遺傳變異水平較高，有較強的適應力;12 個位點在各家系中的平均PIC 為0.440 ～0.584，根據(jù)Botstein等［18］提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，12 個位點在5#、7#、8#家系中表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC ＞0.50)，在3#、9#和10#家系中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.50)，但接近于高度多態(tài)。群體內FIS 反映了觀察雜合度和期望雜合度之間的平衡關系，F(xiàn)IS 值越接近零，基因型的分布就越接近平衡狀態(tài)。當FIS ＞0 時，表明雜合子缺失;當FIS＜0時，表明雜合子過剩［19］。本試驗中6 個建鯉家系FIS 都小于零，表明這6 個建鯉群體存在雜合子過?，F(xiàn)象。綜合各遺傳參數(shù)，6 個建鯉家系遺傳多樣性較為豐富，具有較大的遺傳潛力和選育空間。

3.2 6 個建鯉家系間的遺傳差異和分化

聚類分析結果可以明顯地表現(xiàn)群體間親緣關系的遠近［20］，本試驗中聚類結果表明，3#家系與10#家系間以及8#家系與9#家系間遺傳距離較小，親緣關系比較近;5#家系與8#家系間遺傳距離較大，親緣關系相對比較遠。本試驗中得到的不同家系遺傳距離和聚類關系樹可為今后建鯉家系的選留、構建新家系等提供參考。Fst是衡量群體間遺傳分化的重要指標，當0＜Fst＜0.05 時，表明群體遺傳分化較弱;當0.05＜Fst＜0.15 時，為中度分化;當0.15＜Fst＜0.25 時，為分化較大;當Fst＞0.25 時，表明群體遺傳分化很大［18］。本試驗中AMOVA 結果表明，12 個位點的Fst值平均為0.209 4，即有21%的遺傳變異來源于家系間，79%來源于家系內的個體間，說明家系間有較大的遺傳分化。Nm則是抵抗群體分化、維持群體遺傳均質化的力量，如果群體間Nm＞1，基因流則能發(fā)揮均質化作用，能有效防止不同群體間產生遺傳分化;反之，如果群體間Nm＜1，則表明各群體間基因流受阻，群體可能走向遺傳分化［21］。本試驗中平均Nm為0.962 3，說明6 個建鯉家系基因交流程度偏低，可能會導致家系遺傳分化，可擴大建鯉的選育空間。

3.3 6 個建鯉家系個體間的遺傳差異

本試驗中檢測了所有個體間的遺傳距離，并按父子間、母子間、同胞間和不同家系沒有血緣關系個體間4種遺傳關系進行了分析，提供了這幾種不同親緣關系建鯉個體間的遺傳距離范圍。試驗結果表明，父本、母本與子代間的平均遺傳距離分別為0.333 1和0.347 7，同胞子代間的平均遺傳距離為0.318 0，三者沒有顯著差異，說明親子之間的遺傳距離與同胞子代之間遺傳距離范圍相近。不同家系沒有血緣關系個體間的平均遺傳距離為0.635 3，要顯著大于親子之間和同胞子代之間的遺傳距離，說明沒有血緣關系個體間的遺傳距離與親子間、同胞子代間的遺傳距離有一定的范圍差距。由此，當檢測不明遺傳背景的建鯉個體時，通過計算遺傳距離，再根據(jù)不同親緣關系個體間的遺傳距離范圍，可以大致推斷出它們的親緣關系遠近。家系選擇是重要的傳統(tǒng)選育手段，家系選育的成功很大程度上取決于家系的構建，即親本的選擇配組。Melchinger等［22］認為，遺傳距離與雜種優(yōu)勢呈顯著正相關，親本的遺傳距離越遠，則交配產生雜種優(yōu)勢就越明顯，通過檢測所有個體間的遺傳距離，可在今后構建建鯉家系時指導親本的選擇和配組，這對加強建鯉的種質遺傳改良和培育新品系具有重要意義。

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