補體蛋白C3c 與抑制劑Compstatin的結(jié)合自由能計算

楊威，張峰，馬志，鄭俊峰

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

在人體免疫通路中，補體蛋白C3在細菌或炎灶分解產(chǎn)物的作用下裂解出C3c，C3c是一種參與免疫激活通路中必不可少的蛋白。但是C3c 多度表達會引發(fā)諸多復(fù)雜疾病或癥狀，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、肺出血和腎炎綜合征等疾病，以及異種移植超急性排斥反應(yīng)等癥狀。目前，幾種C3 補體的抑制劑仍處于研發(fā)狀態(tài)，尚未在臨床試驗中應(yīng)用［1-10］。研發(fā)內(nèi)容以CR1(補體受體)補體活化調(diào)節(jié)劑以及對其進行修飾的研究居多，但其結(jié)果對一些疾病的療效卻不盡如人意。近年來發(fā)現(xiàn)的小分子補體抑制劑與上述傳統(tǒng)生物大分子相比，在藥物方式、藥物動力學(xué)方面均有許多優(yōu)點。Morikis等［11］認(rèn)為，C3 結(jié)合肽(Compstatin)可能會通過抑制劑C3 轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)的形成和降低C3 轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定性來抑制C3 的活化，但最新研究［12-13］推測，它是通過結(jié)合到C3 分子的C3c 部分來阻止C3 裂解成C3a和C3b，從而抑制C3 的活化。Compstatin是一種帶13 個氨基酸(ICVVQDWGHHRCT-NH2，在Cys-2-Cys-12 有二硫鍵)的環(huán)狀纖維蛋白多肽(圖1)，它可以有效抑制C3 裂解反應(yīng)中C3 轉(zhuǎn)變成C3b，使之轉(zhuǎn)變成C3c-Compstatin 復(fù)合物，以阻止C3b 進一步與自身物質(zhì)——抗體結(jié)合而提供強烈的清除自身靶點復(fù)合物的信號。Compstatin 因具有抑制效果明顯、分子量小和非免疫原性等特點［14］，已經(jīng)成為一種新的補體抑制劑潛藥。目前，Compstatin 與C3 蛋白結(jié)合的機制尚不明確，因此，進一步研究Compstatin 與C3蛋白的結(jié)合十分必要。本研究中將針對C3c 蛋白與抑制劑的結(jié)合進行模擬研究。

1 模型與計算方法

1.1 C3c-Compstatin 的結(jié)構(gòu)與模型的選取

由于酶的變構(gòu)抑制效應(yīng)，Compstatin在水溶液中的自由狀態(tài)與在結(jié)合于C3 上的狀態(tài)不同。本研究中，復(fù)合物初始結(jié)構(gòu)為C3c-Compstatin 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(PDB ID 2qki)取自于蛋白質(zhì)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)，分辨率為2.4 ?，C3c是C3主要的多肽片段，它由β 鏈(23 ～665 個氨基酸)巨球蛋白域MG1 ～MG7、α 鏈(749 ～936)錨定區(qū)域anchor、α 鏈(1321 ～1663)C345c 區(qū)域組成，其中與抑制劑Compstatin 結(jié)合的是β 鏈上的MG 巨球蛋白域中的MG4 ～MG5 區(qū)域，因為側(cè)鏈anchor和C345c 區(qū)域遠離配體結(jié)合位點，為了節(jié)省計算時間和資源，模型不包括α 鏈(749 ～936)錨定區(qū)域anchor和α 鏈(1321 ～1663)C345c 區(qū)域。利用分子動力學(xué)方法補齊結(jié)晶體缺失的殘基后，制成分子動力學(xué)的輸入文件。

1.2 分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬采用Amber 11 程序包中的Sander 及Pmemd 模塊［15］，受體和配體蛋白全部采用ff99［16］力場。若把整個體系放入水中，總原子數(shù)將超過Amber 11 程序能夠允許的范圍，并且在模擬準(zhǔn)確性下降的同時還會嚴(yán)重影響計算機模擬的時間，為此，采用在距抑制劑Compstatin 質(zhì)心2.0 nm 的復(fù)合物上包一個“水帽”(solvate cap)的方式加水。水溶液采用顯性的TIP3P 模型，為了使整個系統(tǒng)總體電荷為0，添加了1 個鈉離子，分子動力學(xué)初始結(jié)構(gòu)如圖2所示。用SHAKE 法來限制所有含氫鍵的伸縮［17］，模擬步長取2 fs。非鍵相互作用的截斷值(Cutoff)為1.2 nm，在運行分子動力學(xué)之前，根據(jù)Ryckaert等［17］的研究結(jié)果，先用5 000 步最陡下降法(steepest descent method)，緊接著用5 000 步共軛梯度法(conjugate gradient)來消除分子間的高能碰撞;然后約束溶質(zhì)部分，設(shè)定所有水分子及抗衡離子可以移動，將體系升溫到300 K，使其在密度為1 g/cm3時保持平衡;取消溶質(zhì)約束，利用NTP 系宗進行分子動力學(xué)模擬，產(chǎn)生10 ns 的生產(chǎn)相軌跡，只對后1 ns 平衡構(gòu)象進行采樣，每2 ps 取一次構(gòu)象，利用采集的構(gòu)象進行自由能計算。

1.3 自由能的計算公式

采用Amber 11 程序包中的mm_ pbsa.py 模塊，使用 MM/PBSA 方法計算結(jié)合自由能△G［18-21］，其計算公式為

其中:△GMM為分子真空下的內(nèi)能差，通過分子力學(xué)方法獲得，包括真空靜電相互作用能△GELE和真空范德華作用能△GVDW;△S 為通過正則模擬方法計算獲得的熵變;T 為絕對溫度;△GSOLVE為溶劑化自由能差;△GPB為通過求解Poisson-Boltzmann方程［22］獲得的極性溶劑化自由能差;GSA為非極性溶劑化自由能差;SA 為溶劑可及表面的表面積，采用Tsui和Case等建立的參數(shù)，γ和β 分別為0.005 42 kcal/(mol·?)和0.92 kcal/mol［23］，在計算中，溶劑采用介電常數(shù)為78 的連續(xù)介質(zhì)模型，溶質(zhì)的介電常數(shù)視為1，原子的半徑取PARSE 參數(shù)序列。

PBSA 計算中截取的是軌跡穩(wěn)定狀態(tài)的200 幀構(gòu)象，由于利用正則模擬的Nmode 模塊計算熵變非常占內(nèi)存［24］，因此，取穩(wěn)定狀態(tài)的構(gòu)象50 幀，并且切除了距離補體抑制劑2.5 nm 外C、N 兩末端不與配體發(fā)生作用的殘基，在整個體系沒有斷裂共價鍵的構(gòu)象下計算熵變［21］。

1.4 能量分解

本研究中能量分解采用GBSA(Generalized Born/Surface Area)方法［25］來計算。C3c和Compstatin 各個殘基相互作用能的計算公式為

其中:△GVDW和△GELE分別為每個殘基在真空中的范德華作用能和靜電相互作用能;△GGB為每個殘基的極性溶劑化能，該項由廣義的波恩模型計算得到;△GGBsur為非極性溶劑化能，由LCPO 模型計算得到。將每項能量均分解為殘基的主鏈能量貢獻和側(cè)鏈能量貢獻。

2 結(jié)果與討論

2.1 動力學(xué)軌跡

圖3 為C3c 蛋白與抑制劑復(fù)合物的骨架原子(CA、N、C)在整個模擬過程中相對于初始結(jié)構(gòu)隨時間變化的均方根偏差(RMSD)，可以看出在整個10 ns 模擬過程中，RMSD 漲落較小，波動范圍為0 ～2 ?，在前3.5 ns 中，曲線一直在波動中上升，之后進入穩(wěn)定狀態(tài)，RMSD 于1.6 ? 上下浮動，直到模擬結(jié)束時RMSD 不超過2 ?，說明整個模擬體系是穩(wěn)定的。因此，在最后0.4 ns 的軌跡中選取200 個構(gòu)象用于自由能計算是合理的。

2.2 自由能

表1 中列出了各項能量對吉布斯自由能的貢獻。根據(jù)自由能的計算公式，可以得出C3c 與Compstatin 的理論結(jié)合自由能為-8.06 kcal/mol，與試驗值-6.72 kcal/mol［26］比較吻合，在形成復(fù)合物時，分子內(nèi)能總和對配體結(jié)合的貢獻最大，為-177.24 kcal/mol，真空靜電作用能(-108.74 kcal/mol)和范德華作用能(-68.51 kcal/mol)也都有利于補體抑制劑的結(jié)合。

表1 C3c 與Compstatin 結(jié)合自由能的理論計算值和試驗值(ˉx±s)Tab.1 Binding free energy estimated value and experimental energy value between Compstatin and C3c kcal/mol

與眾多文獻一致［21，27-30］，本研究中靜電作用能總和(△GELE+△GPB)為34.35 kcal/mol，不利于配體的結(jié)合，主要表現(xiàn)在極性溶劑化能△GPB(143.09 kcal/mol)阻礙了復(fù)合物的形成，盡管真空靜電作用能△GELE可以補償大部分極性溶劑化能對補體抑制劑Compstatin 結(jié)合所產(chǎn)生的不利影響，但對配體結(jié)合的阻礙仍然存在。

2.3 Compstatin 與C3c 的結(jié)合機制

由復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可知，Compstatin 與C3c形成了9 對氫鍵［26］。以其作為對照比較，將模擬10 ns 的生產(chǎn)相中受體與配體產(chǎn)生的氫鍵列于表2。從表2可見，大部分氫鍵理論計算值和結(jié)晶試驗值相近，模擬過程中沒有發(fā)現(xiàn)ACE0:O-ASN390:OD1和GLN5:NE2-ASP491:OD 之間形成氫鍵，與結(jié)晶試驗略有不同。模擬過程中顯示存在兩對存留時間很長的氫鍵，如圖4-A 中，一對為ALA9 主鏈上的N 與ASP491 側(cè)鏈羧基上的OD1 形成了存活率為95.14%的氫鍵，說明這對氫鍵對抑制劑與C3c 蛋白結(jié)合非常重要;另外一對為 MET457:O與TRP7-NE1，MET457 主鏈上的O 充當(dāng)氫受體，配體TRP7 側(cè)鏈上的NE1 充當(dāng)氫供體，這對氫鍵在模擬過程中存留時間約9 ns，也對穩(wěn)定復(fù)合物的形成作出了有利貢獻。

表2 10 ns 模擬中C3c 與抑制劑之間的氫鍵存活率和距離Tab.2 Occupancy and distance of hydrogen bonds between C3c and Compstatin during 10 ns of MD simulation

為了研究C3c 蛋白與Compstatin 結(jié)合的作用機制，本研究中使用Amber 11 軟件中的GBSA 模塊計算了抑制劑Compstatin 與C3c 上各殘基的相互作用，其主要作用殘基的能量分解見表3。從表3可見，C3c 上的殘基ARG459、ASP491和MET457 與抑制劑Compstatin 上的殘基TRP7、TRP4、HIS10對結(jié)合自由能的貢獻較大。其中受體上每個殘基對結(jié)合能的貢獻比配體上的殘基貢獻要相對小一些。在受體上，雖然ASP491 具有最大的靜電能(-22.19 kcal/mol)，但由于側(cè)鏈上較大的極性溶劑化能(23.17 kcal/mol)與其抵消，使ASP491的貢獻(-2.79 kcal/mol)在受體殘基貢獻中排列第二。受體上結(jié)合自由能貢獻最大的是ARG459(-5.14 kcal/mol)，同樣發(fā)現(xiàn)其側(cè)鏈上有巨大的極性溶劑化能(15.36 kcal/mol)與其靜電能(-16.81 kcal/mol)抵消。而在配體中，殘基TRP7的貢獻力最大(-10.741 kcal/mol)，主要來自其側(cè)鏈上的范德華作用能(-8.80 kcal/mol)。正如在平均結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的，整個TRP7 的側(cè)鏈像一把鑰匙一樣陷在由LEU492、LEU454、ASP491、GLY489、ARG456、MET457、ARG459 組成的空腔中(圖4-B)，另外，配體中TRP7和TRP4 的重要貢獻與最近的試驗結(jié)果吻合［31］。能量分解很好地驗證了C3c和抑制劑Compstatin 的結(jié)合模式。這些結(jié)果為基于C3c 蛋白結(jié)構(gòu)進行合理設(shè)計補體抑制劑提供了線索。

圖1 抑制劑分子Compstatin 的初始結(jié)構(gòu)Fig.1 The initial conformation of Compstatin

圖2 分子動力學(xué)初始結(jié)構(gòu)Fig.2 The initial conformation in molecular dynamics

圖3 C3c 蛋白與抑制劑復(fù)合物的骨架原子(CA、N、C)的RMSD 隨時間的變化Fig.3 Changes in RMSD of the back bone(CA，N，C)in the C3c-compstatin complex with time

圖4 C3c 蛋白與抑制劑結(jié)合位點Fig.4 The binding site of C3c-compstatin

3 結(jié)論

本研究中采用了MM-PBSA 結(jié)合自由能計算和GBSA 能量分解的方法，經(jīng)過10 ns的分子動力學(xué)取樣，計算了C3c 蛋白和Compstatin 復(fù)合物的結(jié)合作用能，計算的結(jié)合能結(jié)果與試驗值吻合度較好，并且推斷出對結(jié)合起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。本研究表明，范德華作用能和非極性溶劑化能對復(fù)合物結(jié)合起主導(dǎo)作用，如真空靜電作用能(-108.74 kcal/mol)和范德華作用能(-68.51 kcal/mol)為補體抑制劑結(jié)合提供主要貢獻。研究中還發(fā)現(xiàn):受體上ASP491 參與形成的氫鍵時間最長(9.5 ns)，能量分解中其靜電能貢獻也最大(-22.19 kcal/mol);配體上TRP7 參與形成的氫鍵時間最長(8.9 ns)，能量分解中其結(jié)合能貢獻也最大(-10.74 kcal/mol)。從能量分解中可以看出，TRP7 側(cè)鏈的范德華作用力為-8.80 kcal/mol，再次說明范德華能對結(jié)合非常有利，而從平均結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的TRP 吲哚基團恰好插入在結(jié)合位點所形成的空腔中，也為能量計算進行了輔證。通過氫鍵分析和能量分解進一步推斷出影響受體和配體結(jié)合的重要氨基酸TRP7、TRP4 及氫鍵ASP491:OD1-ALA9:N和MET457:O-TRP7-NE1，這一結(jié)果填補了X-ray 結(jié)晶試驗所得不到的分子動態(tài)結(jié)合的信息，為設(shè)計高效的人類補體C3c 蛋白抑制劑提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。

表3 用GB 方法進行能量分解的主要貢獻殘基各部分的能量值Tab.3 Energy contribution of the key residues computed by GB model kcal/mol

致謝:感謝大連理工大學(xué)李艷教授提供Amber軟件!

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