復(fù)方中草藥對大菱鲆非特異性免疫力的影響

李華，張?zhí)穑顝?/p>

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

大菱鲆Scophthalmus maximus是中國北方地區(qū)的主要海水養(yǎng)殖品種之一，隨著養(yǎng)殖業(yè)不斷向集約化、規(guī)模化發(fā)展，給魚類疾病防治提出了新的課題。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中由于抗生素等藥物長期使用或用藥不當(dāng)，不僅使微生物產(chǎn)生抗藥性，耐藥菌株不斷增加，水產(chǎn)動物免疫功能下降，同時也造成了巨大的經(jīng)濟損失，如“多寶魚藥殘事件”使整個大菱鲆產(chǎn)業(yè)受到了沉重打擊。因此，如何提高健康養(yǎng)殖水平，為人們提供優(yōu)質(zhì)綠色的海產(chǎn)品，成為當(dāng)前的首要任務(wù)。

應(yīng)用中草藥作為免疫增強劑不但可以解決化學(xué)藥物、抗生素等引發(fā)的抗(耐)藥性和養(yǎng)殖魚類藥殘超標(biāo)等問題，而且符合發(fā)展無公害漁業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的需求［1-2］。國內(nèi)外很多學(xué)者研究證明，中草藥免疫增強劑可明顯增強水產(chǎn)動物的抗病能力，國外學(xué)者Rao等［3］、Christybapita等［4］以單方中草藥牛膝和旱蓮草分別投喂露斯塔野鯪和羅非魚，結(jié)果表明能顯著提高機體的免疫力。國內(nèi)學(xué)者用復(fù)方中草藥投喂羅非魚［5］、牙鲆［6］、草魚［7］等，均能有效地提高機體的非特異性免疫力。大菱鲆是近年來推廣的養(yǎng)殖品種，有關(guān)中草藥對它的作用效果及作用水平等尚未見報道。本研究中作者通過在飼料中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中草藥投喂大菱鲆，測定其非特異性免疫指標(biāo)以及機體的抗病力，研究其對大菱鲆的免疫效果，進而為在大菱鲆養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用中草藥免疫增強劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用大菱鲆購自大連雙龍海產(chǎn)品有限公司，規(guī)格整齊，體質(zhì)健壯，體質(zhì)量為(29.00±1.82)g，體長為10 ～14 cm，共100 尾。試驗魚飼養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，水族箱體積為120 L，暫養(yǎng)10 d 后用于試驗。暫養(yǎng)期間水溫為16 ～19℃，鹽度為31 ～33，pH 為7.8 ～8.3，24 h 不間斷充氣，日換水1次，換水量為1/3。每日8:00和17:00 投喂飼料，投飼率為魚體質(zhì)量的3% ～4%。

復(fù)方中草藥為牛膝、板藍根、甘草、陳皮、肉桂、麥芽、神曲7 味中草藥，粉碎后經(jīng)80 目篩網(wǎng)過濾，按一定比例混勻，分別以2%、4%、6%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加于大菱鲆基礎(chǔ)飼料(山東升索漁用飼料研究中心)中制粒，粒徑為2.0 ～2.5 mm，長度約4 mm，陰干后于低溫下保存?zhèn)溆?。對照組飼料為不添加中草藥的基礎(chǔ)飼料。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 采用單因子濃度梯度設(shè)計方法，將試驗魚隨機分為4 個試驗組，分別投喂基礎(chǔ)飼料和添加2%、4%、6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中草藥飼料，并分別記為對照組和2%、4%、6%濃度組。各組均設(shè)3 個平行，每個平行放8 尾魚，連續(xù)投喂28 d。試驗期間環(huán)境條件和飼養(yǎng)管理等同暫養(yǎng)期。

1.2.2 樣品的制備 于試驗開始前和開始后第7、14、21、28天采樣，每次從每組采集3 尾魚，用電子秤測量體質(zhì)量(精確至0.1 g)。用酒精棉將魚體消毒后，從尾靜脈采血，分離血清，并于-80℃下保存?zhèn)溆?。解剖魚腹腔，取頭腎，置于180 目金屬網(wǎng)，用無菌藥匙將單細胞擠于盛有RPIM-1640 的無菌小燒杯中。收集細胞懸液，以600 r/min 離心10 min，洗滌3次，收集細胞并用RPIM-1640 調(diào)整細胞濃度至1.0×107個/mL，即為頭腎吞噬細胞液。

1.2.3 指標(biāo)的測定

1)溶菌酶活力。參考王雷等［8］的方法進行。用0.1 mol/L 的磷酸鉀緩沖液(pH 6.4)配制溶壁微球菌懸液(OD570nm=0.3)。取3 mL 于試管內(nèi)并置于冰浴中，加入50 μL 待測血清，讀取570 nm處的吸光度A0。將試液移入37 ℃下溫育30 min，取出后立即置于冰浴內(nèi)10 min 中止反應(yīng)，讀取570 nm 處的吸光度A。溶菌酶活力計算公式為

2)抗菌活力。采用改進的Hultmark等［9］的方法。將大菱鲆血清(10 μL/孔)加至96 孔酶標(biāo)板中，再加入90 μL 0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.4)，讀取490 nm 處的吸光度A1n;再加入100 μL 磷酸鉀緩沖液，讀取490 nm 處的吸光度A2n。計算系統(tǒng)誤差式中n 為樣本編號，N為樣本總數(shù)。將待測血清液移入酶標(biāo)板相應(yīng)的孔中(10 μL /孔)，加入90 μL 0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.4)，讀取630 nm 處的吸光度AK;取出96 孔板，往相應(yīng)列的孔內(nèi)分別加入100 μL 大腸桿菌懸液，搖勻后讀取630 nm 處的吸光度A0;于37 ℃下溫育30 min，讀取490 nm 處的吸光度A。抗菌活力(Ua)按下列公式計算:

若A0≤A 時，Ua 均以0 作為結(jié)果。

3)抗蛋白酶活力。參考王宏田等［10］的方法進行。抗蛋白酶活力通過抑制蛋白酶水解酪蛋白的能力來表示，采用酶標(biāo)儀讀取630 nm 處的OD 值，以樣品每分鐘使胰蛋白酶活力降低的數(shù)值，表示蛋白酶活性物質(zhì)的活力。

4)補體C3 的含量。采用補體C3 檢測試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)，按說明書操作。

5)NBT 陽性細胞數(shù)。參照簡紀(jì)常等［11］的方法進行。取50 μL 血細胞滴于蓋玻片上，在室溫下用濕盒孵育40 min，在0.067 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)中輕輕洗滌蓋玻片以完全去除紅細胞，再在蓋玻片上滴加50 μL 2 mg/L NBT 溶液，濕盒下溫育40 min。在顯微鏡下觀察，被染成黑色或棕色的細胞即為NBT 陽性細胞。每尾魚觀察10 個視野，再計算一組魚中平均1 個視野內(nèi)的NBT 陽性細胞數(shù)。

6)頭腎白細胞吞噬活性。參照李海平等［12］的方法，稍加改進。制備酵母菌懸液，用1%美藍染色，洗滌，制成1.2×107個/mL 菌懸液于冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ》蛛x的頭腎白細胞液100 μL 注入離心管中，滴加100 μL 染色酵母菌液，于37 ℃下孵育45 min。用滴管吸取上述混合液滴片，加蓋玻片后直接用高倍鏡觀察，計數(shù)100 個吞噬細胞中參與吞噬的白細胞數(shù)，即為細胞吞噬百分比。

7)抗病力。投喂結(jié)束后，用遲鈍愛德華氏菌Edwardsiella tarda 進行攻毒感染試驗。從每組取9尾魚，采用腹腔注射方式，每尾注射250 μL 濃度為2.6×108個/mL 的菌液，連續(xù)觀察7 d，記錄各組魚的死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶活力

從圖1可見:2%濃度組大菱鲆血清溶菌酶活力隨試驗時間的延長逐漸升高，但始終維持在較低水平;4%和6%濃度組隨試驗時間的延長均呈先升高后降低的趨勢，第14天時達到最高值。多重比較結(jié)果表明，除第28天外，4%和6%濃度組魚血清溶菌酶活力在各采樣時間均顯著高于對照組和2%濃度組(P＜0.05)，且4%濃度組酶活力維持時間更長。

圖1 復(fù)方中草藥對大菱鲆血清溶菌酶活力的影響Fig.1 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum lysozyme activity in turbot Scophthalmus maximus

2.2 抗菌活力

從圖2可見:第7天時，4%和6%濃度組魚血清抗菌活力顯著高于對照組和2%濃度組(P＜0.05);第14天時，6%濃度組魚血清抗菌活力迅速升高，顯著高于其他組(P＜0.05);之后隨試驗時間的延長，4%濃度組魚血清抗菌活力逐漸升高，接近6%濃度組水平，且顯著高于對照組和2%濃度組(P＜0.05);第28天時，6%濃度組魚血清抗菌活力迅速降低，顯著低于4%濃度組(P＜0.05)。

圖2 復(fù)方中草藥對大菱鲆血清抗菌活力的影響Fig.2 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum antibacterial activity in turbot S.maximus

2.3 抗蛋白酶活力

從圖3可見:2%和4%濃度組大菱鲆血清抗蛋白酶活力隨時間的延長均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，分別在第14天和第21天時達到最低值;6%濃度組魚血清抗蛋白酶活力則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第14天時達到最高值。多重比較結(jié)果表明:前2 周，4%和6%濃度組魚血清抗蛋白酶活力保持在較高水平;后2 周，2%濃度組魚血清抗蛋白酶活力逐漸升高，且顯著高于其他組(P＜0.05)，6%濃度組顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖3 復(fù)方中草藥對大菱鲆血清抗蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of compound Chinese herbal medicine on serum antiprotease activity in turbot S.maximus

2.4 補體C3

從圖4可見:2%濃度組大菱鲆血清補體C3 含量在整個試驗周期內(nèi)波動較小，接近對照組;4%和6%濃度組魚血清C3 含量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分別在第21天和第14天時達到峰值，第28天時降至接近初始值。多重比較結(jié)果表明，第14天時，6%濃度組魚血清補體C3 含量顯著高于其他各組(P＜0.05)，4%濃度組次之;第21天時，4%濃度組血清補體C3 含量則顯著高于其他各組(P＜0.05)。

圖4 復(fù)方中草藥對大菱鲆血清補體C3 含量的影響Fig.4 Effect of compound Chinese herbal medicine on content of serum complement C3 in turbot S.maximus

2.5 NBT 陽性細胞數(shù)

從表1可見:2%濃度組平均1 個視野中NBT陽性細胞數(shù)在第14天有小幅升高，之后波動較小;4%濃度組NBT 陽性細胞數(shù)前3 周一直處于升高趨勢，3 周后維持穩(wěn)定;6%濃度組第7天時NBT 陽性細胞數(shù)就明顯升高，之后有小幅上下波動，但始終維持高水平;對照組在4 周內(nèi)一直維持相對較低水平，且無明顯波動。多重比較結(jié)果表明，2%、4%、6%濃度組在各采樣時間與對照組相比均有顯著升高(P＜0.05)(除2%組第7天外)，且4%和6%濃度組NBT 陽性細胞數(shù)升高更為明顯。

表1 復(fù)方中草藥對大菱鲆NBT 陽性細胞數(shù)的影響Tab.1 Effect of compound Chinese herbal medicine on NBT－positive cells in turbot S.maximus

2.6 頭腎白細胞吞噬活性

頭腎白細胞的吞噬活性由細胞的吞噬率來表示，測定結(jié)果見表2。從表2可見:4%和6%濃度組大菱鲆頭腎白細胞吞噬百分比在試驗前2 周變化不大，第21天時有小幅上升，第28天時達到峰值，且顯著高于對照組和2%濃度組(P＜0.05);在整個試驗期間，2%濃度組白細胞吞噬百分比與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 復(fù)方中草藥對大菱鲆白細胞吞噬活性的影響Tab.2 Effect of compound Chinese herbal medicine on phagocytic activity of leucocytes in turbot S.maximus

2.7 抗病力

攻毒試驗結(jié)果表明，2%、4%、6%組存活率均高于對照組。從表3可見:2%濃度組前3 d 存活率均為100%，第4天開始死亡，在第5、6天存活率逐漸降低，第7天時全部死亡;4%濃度組前4 d 存活率為100%，第5天時開始死亡;6%濃度組，前2 d 存活率為100%，第3天開始死亡，到第6天時全部死亡。各組的存活率從大到小依次為4%濃度組＞2%濃度組＞6%濃度組＞對照組。

表3 攻毒后不同試驗組大菱鲆的存活率Tab.3 Survival rate in turbot S.maximus fed the diet containing compound Chinese herbal medicine after challenged with pathogen Edwardsiella tarda

3 討論

本復(fù)方以牛膝為主藥，配以常見的板藍根、甘草等中草藥，其藥物成分包括生物堿、多糖、皂甙、揮發(fā)油、甘草甜素、多種氨基酸等［13-14］。牛膝含有多種免疫活性多糖，在國內(nèi)多用于治療人類疾病，很少應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。本試驗結(jié)果表明，該復(fù)方作為免疫增強劑投喂大菱鲆，可顯著提高其溶菌酶活性、抗菌活力、抗蛋白酶活力等非特異性免疫指標(biāo)。魚類的特異性免疫機制還很不完善，其非特異性免疫系統(tǒng)仍扮演著重要角色，因此，通過激活抗菌活力、溶菌活力、免疫酶活力以及活化吞噬細胞的吞噬殺菌功能等途徑來殺滅入侵的病原物，提高魚體的非特異免疫活性，增強魚類的免疫應(yīng)答水平是非常重要的［15］。

魚體內(nèi)溶菌酶的活性和抗菌活力直接關(guān)系到魚類的免疫功能和健康。中草藥對魚類溶菌酶活性調(diào)節(jié)的報道也很多，董艷珍等［16］、Yin等［17］分別用兩種中草藥的提取液拌餌投喂金鯽和羅非魚，結(jié)果均顯示魚血清溶菌酶活性明顯升高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，投喂中草藥復(fù)方后可顯著提高大菱鲆血清溶菌酶活力，尤其是4%濃度組，對溶菌酶活性影響較顯著，且持續(xù)時間較長。在本試驗中，復(fù)方中草藥能顯著提高大菱鲆血清抗菌活力，作用迅速但維持時間較短。陳志款等［18］用添加復(fù)方中草藥的飼料連續(xù)投喂紅笛鯛，能顯著增強魚血清的抗菌活力，并呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與本試驗結(jié)果基本相似。

補體C3是補體系統(tǒng)的重要成分，主要參與旁路激活途徑。旁路途徑使機體在初次接觸抗原時，即可活化補體發(fā)揮其殺滅作用，表明了補體C3在非特異性免疫中的重要性［19］。本試驗結(jié)果表明，2%濃度組補體C3 含量較對照組無明顯變化，4%濃度組則顯著升高，6%濃度組雖可以提高補體C3的含量，但持續(xù)時間較短，后期迅速降低。李桂峰等［20］分別用添加4種不同酵母多糖含量的飼料投喂赤眼鱒，結(jié)果高濃度添加組能顯著提高補體C3的水平，這與本試驗結(jié)果相似。

吞噬細胞在防御外來微生物感染過程中發(fā)揮重要作用，魚類吞噬細胞的吞噬活性不僅受溫度的影響，而且還受到餌料、免疫激活劑的影響。本試驗結(jié)果表明，2%濃度組與對照組無顯著性差異;4%和6%濃度組在第1 周時，白細胞的吞噬活性比對照組顯著升高，之后3 周內(nèi)持續(xù)升高。國外學(xué)者Rao等［3］用添加牛膝的飼料投喂露斯塔野鯪，0.5%的添加量使細胞的吞噬活性有顯著升高。李超等［7］用中草藥投喂草魚，各試驗組吞噬細胞的吞噬活力均顯著高于對照組。吞噬細胞包括單核細胞、巨噬細胞和各種粒細胞，統(tǒng)稱為NBT 陽性細胞，是重要的非特異性免疫因素，這些細胞吞噬了NBT 后，胞質(zhì)中的葡萄糖-6-磷酸氧化所脫下的氫被NBT 接受，使淡黃色的NBT 還原成棕黑色的顆粒，因而，NBT是研究這3種細胞數(shù)量和吞噬能力極好的指示劑［11］。本試驗中各試驗組NBT 陽性細胞數(shù)較對照組發(fā)生顯著變化，4%濃度組和6%濃度組血清中的NBT 陽性細胞數(shù)均有顯著提高。史會來等［21］使用中草藥投喂真鯛幼魚，結(jié)果表明，能顯著影響血液中NBT 陽性細胞數(shù)。

魚體能夠預(yù)防細菌的侵入，抑制細菌在機體內(nèi)繁殖的蛋白酶抑制物主要是α1 抗胰蛋白酶和α2巨球蛋白，因此，總抗蛋白酶的活性也是反映機體免疫狀態(tài)的重要免疫指標(biāo)。本試驗中，2%濃度組魚血清抗蛋白酶活力呈緩慢升高趨勢，4%濃度組酶活力上下波動，不夠穩(wěn)定，6%濃度組酶活力緩慢升高，之后降低。Christybapita等［4］研究表明，使用不同濃度的旱蓮草提取物投喂羅非魚，其抗蛋白酶的活性在第2 周和第3 周比對照組均有顯著提高。本試驗變化趨勢和以上學(xué)者的研究略有差異，其原因有待于進一步探討。

攻毒試驗是免疫增強劑效果最直觀的反映，對照組及試驗組魚經(jīng)活菌攻毒后，各組的存活情況均發(fā)生了不同的變化，2%、4%、6%濃度組比對照組存活率均有提高，各組存活率從大到小依次為4%濃度組＞2%濃度組＞6%濃度組＞對照組。本試驗結(jié)果與Divyagnaneswari［22］的研究結(jié)果相似，該學(xué)者將茄屬草藥添加于飼料中，投喂紅羅非魚，結(jié)果能顯著提高羅非魚的免疫力和抗病力。由此可以看出，本試驗中添加中草藥對試驗魚起到了一定的免疫保護作用，以4%濃度組的存活率為最高。

綜上所述，本試驗中所采用的中草藥對大菱鲆具有一定的免疫調(diào)節(jié)及增強作用，可顯著提高大菱鲆的非特異性免疫力，且對抵抗病原菌的感染具有一定的增強作用，說明該中草藥復(fù)方制劑的多種免疫活性物質(zhì)對大菱鲆具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗結(jié)果也表明，不同免疫指標(biāo)達到最高水平所需要的時間和劑量各不相同。添加6%的高濃度組，某些免疫指標(biāo)雖變化顯著，但表現(xiàn)出一定的副作用，其溶菌酶和抗菌活力、抗病力等指標(biāo)不如4%濃度組，說明添加高濃度中草藥抑制了魚體的免疫力和抗病力。作者認(rèn)為本試驗所采用的中草藥復(fù)方制劑，完全可以作為免疫增強劑在大菱鲆養(yǎng)殖中使用，以4%添加量為宜，合適的投喂時間和周期有待進一步試驗確定。此外，中草藥的粒徑和添加量具有密不可分的關(guān)系，本試驗中中草藥粉碎后采用80 目過濾篩網(wǎng)，在實際生產(chǎn)中可通過縮小中草藥粒徑減少添加量，不僅可以降低成本而且還可以提高免疫效果。

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