核苷類化合物含量測定方法的研究進展*

李　靜，朱靜毅

(揚州市藥品檢驗所，揚州　225009)

核苷類化合物包括腺嘌呤、腺苷、3-脫氧腺苷(蟲草素)、尿嘧啶、尿苷、鳥嘌呤、鳥苷、次黃嘌呤、胸嘧啶、胞苷等等。研究發(fā)現(xiàn)[1,2]核苷類化學(xué)成分對人體免疫、代謝以及肝臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮著重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性，尤以腺苷的藥理作用最為明顯[3]，如腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等。

核苷類化合物廣泛存在于冬蟲夏草、板藍根、靈芝等中藥材中，因其通常是中藥活性成分，故核苷類化學(xué)成分的含量可以作為中藥材的質(zhì)量控制指標。例如腺苷已被用作冬蟲夏草的質(zhì)控指標，《中國藥典》 2010年版把腺苷定為發(fā)酵蟲草菌粉的含量測定項目，規(guī)定蟲草含腺苷不得少于0.010%。為此本文對核苷類化合物的含量測定方法做一綜述，為今后核苷類化合物的研究提供參考。

1　HPLC法

高效液相色譜(HPLC)是以液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。該方法因其高效、高靈敏度、分析速度快的特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)、農(nóng)學(xué)等研究領(lǐng)域。根據(jù)檢測器的不同，可分為HPLC-UV法、HPLC-DAD法和HPLC-MS法。

1.1HPLC-UV法在已經(jīng)報道的HPLC法測定核苷類化合物含量的文獻中，最常見的就是使用普通紫外檢測器檢測。根據(jù)流動相的洗脫方法不同可分為等度洗脫和梯度洗脫。

1.1.1等度洗脫應(yīng)用等度洗脫法進行HPLC測定核苷類化合物含量的文獻報道較多。

王棘等[4]采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(pH 7.8-8.0) -乙腈(83∶17)為流動相，檢測波長260 nm，測定了尿苷、腺苷、次黃嘌呤核苷的含量。姚靜倩等[5]采用Lichrosper-C18柱，以水為流動相洗脫，檢測波長254 nm，測定了三角帆蚌中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷和胸腺嘧啶的含量，且方法簡便又經(jīng)濟環(huán)保。王夢月等[6]應(yīng)用Waters C18反相色譜柱，檢測波長260 nm，流動相0.05 mol/L KH2PO4-乙腈(97∶3)，同時測定了海龍中胸腺嘧啶、次黃嘌呤、尿嘧啶3種核苷類成分。為取得較理想分離效果，本實驗比較了不同比例的甲醇-水和乙腈-水的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水(3∶97)效果較好，但總體分離效果仍不理想，為此考查了向流動相中加入醋酸、三氟乙酸、四氫呋喃、磷酸二氫鉀后的分離效果，發(fā)現(xiàn)加入磷酸二氫鉀較理想。因此，最終確定流動相0.05 mol/L KH2PO4-乙腈(97∶ 3)。

周惠燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，核苷類化合物的含量測定主要使用兩種流動相系統(tǒng)：一種為含磷酸鹽緩沖液的流動相，一種為不含磷酸鹽緩沖液的流動相。其中，核苷類化合物在含磷酸鹽緩沖液的流動相中分離時間較短，保留時間基本在10 min左右，但在測定多個核苷類化合物時，和雜質(zhì)分離度不夠高；而在不含磷酸鹽緩沖液的流動相中分離時間較長，保留時間較長，為25～40 min，峰形易擴散，但是分離度很好，且因為不含鹽，減少了對色譜柱的損傷。

1.1.2梯度洗脫在液相色譜中，對組分復(fù)雜的樣品，當采用等度洗脫時，常常出現(xiàn)各峰分離度較差，或峰完全分離時間過長的問題；而使用梯度洗脫時既可縮短分離時間，提高分離能力，又能改善峰型，增加靈敏度，是一種較好的流動相系統(tǒng)。

張元杰等[8]采用Zorbax SB-Aq分析柱；流動相為0.05%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～12 min，0%B；12～17 min，0%B→2%B；17～27 min，2%B；27～45 min，2%B→20%B)，流速0.5 ml/ min；檢測波長260 nm。在此條件下，成功分析了尿苷、鳥苷、腺苷、腺嘌呤4個核甘類化學(xué)成分在6種常用補益中藥人參、黃芪、熟地黃、當歸、麥冬和肉蓯蓉中的含量。張建芝等[9]采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨-乙酸緩沖鹽(pH=4.30)作為流動相，以1 ml/ min的流速進行梯度洗脫(洗脫梯度程序為：0～10 min，0%→l%A；10～20 min，1%→5%A；20～25 min，5%A； 25～35 min，5%→30%A；35～37 min，30%→0%A；37～40 min，0%A )，同時測定了貝母藥材中尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷等5種核苷類化合物。

1.2HPLC-DAD法液相色譜法分析核苷類化合物一般采用紫外檢測器，以保留時間定性。但對于成分復(fù)雜的樣品來說，不同的物質(zhì)可能在同一時間或極相近的時間出峰，僅靠保留時間定性可能會造成分析錯誤。而應(yīng)用二極管陣列檢測器(DAD)可以在線掃描樣品的光譜圖，鑒定色譜峰的純度，分辨重疊峰，得到各組分的純色譜和光譜曲線，從而根據(jù)組分的保留時間和光譜兩方面信息，用于定性及定量。

張海娟等[10]采用Agilent Zorbax Bonux-RP C18色譜柱，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫。通過暗紫貝母樣品峰的光譜圖與混合對照品的光譜圖比較，鑒別并定量測定了暗紫貝母中尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、肌苷、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶等10個核苷類化合物的含量，方法簡單，重復(fù)性好，準確可靠。陳鋼等[11]采用Waters高效液相色譜儀，應(yīng)用Waters 2696二極管陣列檢測器，流動相為乙腈-水，梯度洗脫，測定了半夏中鳥苷、尿苷的含量，并建立了半夏藥材的指紋圖譜。該方法簡單、快速、準確，可作為半夏質(zhì)量控制的方法。

1.3液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)法液質(zhì)聯(lián)用又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。樣品在流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜與質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜高選擇性、高靈敏度及可提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析和食品分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

周菊峰等[12]采用以下質(zhì)譜檢測條件：電噴霧離子化(ESI)；正離子；選擇性離子檢測m/z，腺嘌呤136[M+H]+，腺苷268[M+H]+；蟲草素252[M+H]+；2-氯腺苷(內(nèi)標，IS) 302[M+H]+。ESI源溫度380 ℃；脫溶劑和加熱塊溫度分別為250 ℃和200 ℃；源電壓+4.0 kV；檢測電壓1.5 kV；脫溶劑電壓-18 V；Q-陣列偏轉(zhuǎn)電壓45 V，霧化氣(N2)，分別建立了腺嘌呤、腺苷、蟲草素的線性回歸方程，同時快速測定冬蟲夏草中腺嘌呤、腺苷和蟲草素含量的方法。該方法靈敏、快速、選擇性較好。黃蘭芳[13]采用HPLC-ESI-MS法，選擇性離子檢測，建立了冬蟲夏草及其代用品中蟲草素的測定方法。經(jīng)考查，該方法簡便易行，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可適用于測定冬蟲夏草及其代用品中蟲草素的含量和質(zhì)量評價。

2　毛細管電泳法

毛細管電泳技術(shù)(CE)是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)。CE具有分離效率高、分析速度快、樣品及溶劑消耗量小、分離模式多等優(yōu)點，廣泛用于生物及醫(yī)藥領(lǐng)域。而毛細管區(qū)帶電泳(CZE)和膠束電動毛細管電泳(MEKC)是兩種最常用的毛細管電泳分離模式。將CE與MS聯(lián)用可以提高檢測的靈敏度與選擇性，獲得大量的結(jié)構(gòu)信息，更適合復(fù)雜基質(zhì)中多種核苷類成分的分析。

祝玲等[14]應(yīng)用毛細管區(qū)帶電泳法，通過優(yōu)化緩沖體系、緩沖溶液濃度、酸度及分離電壓等實驗條件，最后采用20 mmol/L硼砂-15 mmol/L環(huán)糊精為緩沖溶液(pH 9.4)，分離電壓為22 kV，檢測波長為254 nm，在10 min內(nèi)同時分離測定了冬蟲夏草菌絲體粉及鹿茸血制品中蟲草素、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷和肌苷等9種核苷，方法經(jīng)濟、簡單、快速。鄭育芳等[15]應(yīng)用膠束電動毛細管法，通過苯基硼酸親和色譜柱對尿中核苷進行純化，以十二烷基磺酸鈉-十水合四硼酸鈉-磷酸二氫鈉為緩沖液(pH 6.96)，在未涂層石英毛細柱上，于7kV 恒壓，29 ℃下進行電泳分離，檢測波長為254 nm，定性并定量測定了28個正常人尿中14種核苷，適合于監(jiān)測癌癥病人尿中核苷濃度的變化。

史倩等[16]分別以四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸銨和乙二胺為背景電解質(zhì)，對毛細管區(qū)帶電泳、毛細管電泳-電噴霧飛行時間質(zhì)譜以及膠束電動毛細管電泳3種模式進行比較，并優(yōu)化了不同的緩沖液體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛細管電泳-電噴霧飛行時間質(zhì)譜分析中，以20 mmol/L乙酸銨(pH 10.0)為背景電解質(zhì)，正離子模式檢測，15種核苷類化合物的質(zhì)譜信號均良好，檢測靈敏度明顯優(yōu)于文獻中報道的使用乙二胺緩沖體系的結(jié)果。由于質(zhì)譜檢測器能夠獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，這種方法在天然食物、食品、尿液、血液等復(fù)雜基質(zhì)樣品中核苷類化學(xué)成分的分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3　薄層色譜掃描法

薄層色譜掃描(TLCS)法具有快速、經(jīng)濟可靠、操作簡單、分離效果較好、時間較短等優(yōu)點，是一種重要的分析分離手段與方法。其既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備，尤其適用于中藥材中復(fù)雜天然物的組分分離及定性、定量分析，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。

馬艷等[17]采用以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板，以氯仿-乙酸乙酯-異丙醇-水-氨水( 8∶ 2∶ 6∶ 0.5∶ 0.12)為展開劑，雙波長反射法鋸齒掃描，測定波長為254 nm，參比波長為300 nm，建立以雙波長薄層掃描法測定蟲草類制劑中核苷類化合物含量的方法。趙雪梅等[18]采用80%乙醇分別超聲提取泰山蟲草菌絲體和天然冬蟲夏草，在GF 254硅膠板上點樣后，以薄層色譜掃描法測定腺苷、尿苷、次黃嘌呤核苷、蟲草素及次黃嘌呤等成分的含量。該方法簡捷快速，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，能有效地對泰山蟲草菌絲體及冬蟲夏草中有效成分進行定性定量分析。

4　紫外可見分光光度法

分子吸收波長范圍在200～400 nm區(qū)間的電磁波產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外吸收光譜，簡稱紫外光譜(UV)。紫外分光光度法則是根據(jù)物質(zhì)分子的這一吸收特性建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。

李泳等[19]先利用紫外可見分光光度計進行標準測定，以擬定標準回歸公式，再將提取樣品利用分光光度計檢測。結(jié)果得出蟲草素的最大吸收波長為259 nm，蟲草素吸光度與蟲草素濃度間的標準回歸方程為Y=65.5143X+0.0386(R2=0.9801)，結(jié)合回歸系數(shù)從而獲得經(jīng)驗公式：蟲草素的濃度C(mol/L)=0.0153×A，并且利用該方法測定了幾種提取樣品的蟲草素含量。

5　結(jié)語

綜上所述，近年來核苷類化合物含量測定的常用方法主要包括HPLC-UV法、HPLC-DAD法、HPLC-MS法、毛細管電泳法、薄層色譜掃描法、紫外可見分光光度法，這些方法各有特點。高效液相不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍較廣；缺點是樣品分析時間長、色譜柱易污染、分析運營成本高。在HPLC法中，如選用MS檢測器，方法的專屬性強，靈敏度高、選擇性好，但是檢測設(shè)備昂貴。毛細管電泳法的特點是樣品預(yù)處理簡單，同時可測定多個成分的含量，較HPLC法簡便、快速。薄層色譜掃描法和紫外可見分光光度法的特點是儀器設(shè)備要求低，操作簡便，但方法的靈敏度和重現(xiàn)性差。

由于核苷類化合物特殊的藥理活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域受到越來越多的重視。發(fā)展快速、 簡便、靈敏、準確的含量測定方法是研究開發(fā)和應(yīng)用核苷類化合物的基礎(chǔ)，有待進一步研究。

1張雪梅, 楊豐慶, 夏之寧. 食品中核苷類成分的藥理作用研究進展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(9): 277

2呂愛娟, 吳皓. 中藥中核苷類成分的研究進展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2006, 13(7): 94

3王麗鳳, 鄭延松. 腺苷在心血管疾病中的應(yīng)用[J]. 中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 3(15): 1518

4王棘, 畢開順. HPLC測定寧心寶膠囊中核苷類化合物含量[J]. 中成藥, 2008, 30(4): 537

5姚靜倩, 昊皓, 王令充, 等. HPLC測定三角帆蚌中主要核苷類成分的含量[J]. 中國海洋藥物雜志, 2009, 28(4): 31

6王夢月, 韋靜斐, 史海明, 等. HPLC法測定海龍中胸腺嘧啶、次黃嘌呤、尿嘧啶的含量[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(17): 2277

7周惠燕, 陳鈺, 許麗麗. 冬蟲夏草中核苷類化學(xué)成分的含量測定研究進展[J]. 中成藥, 2011, 33(11): 1955

8張元杰, 錢正明, 陳肖家, 等. HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量[J]. 藥物分析雜志, 2010, 30(1): 33

9張建芝, 宋昌慧, 陳波, 等. RP-HPLC同時測定貝母藥材中5種核苷類化合物[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(1): 67

10張海娟, 馬世震, 肖遠燦, 等. RP-HPLC同時測定暗紫貝母中10個核苷及堿基類成分的含量[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(6): 986

11陳鋼, 崔小兵, 談獻和, 等. 半夏藥材中鳥苷和尿苷的含量測定及半夏指紋圖譜研究[J].西北藥學(xué)雜志, 2011, 26(5): 313

12周菊峰, 黃蘭芳, 郭方遒. LC-ESI-MS快速同時測定冬蟲夏草中主要核苷類成分[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(18): 2349

13祝玲, 申貴雋, 王莉莉, 等. 毛細管區(qū)帶電泳法測定冬蟲夏草及鹿茸制品中核苷和堿基成分[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2012, 28(3): 343

14黃蘭芳, 郭方遒, 梁逸曾, 等. HPLC-ESI-MS測定冬蟲夏草和蠶蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(8): 762

15鄭育芳, 張云, 劉大漁, 等. 膠束電動力學(xué)毛細管色譜法測定尿中核苷[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報, 2001, 22(6): 912

16史倩, 陳軍輝, 李鑫, 等. 不同緩沖體系對毛細管電泳法分離15種核苷類化合物效果的比較[J]. 色譜, 2011, 29(6): 481

17馬艷, 汪宇, 楊光照, 等. 雙波長薄層掃描法測定蟲草類制劑中核苷類化合物的含量[J].中國藥房, 2008, 19(30): 2375

18趙雪梅, 畢研平, 蘇延友, 等. 泰山蟲草菌絲體與冬蟲夏草有效成分的TLCS分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(3): 126

19李泳, 余潮彬, 張兆霞, 等. 紫外可見分光光度法測定蟲草素含量[J]. 廣東化工, 2012, 39(11): 186