單端孢霉烯族毒素毒性、檢測和脫毒研究進展

薛華麗，畢 陽*，王 毅，葛永紅，李永才

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)是一類化學(xué)性質(zhì)相近的真菌毒素，由鐮刀菌(Fusarium)、木霉(Trichoderma)、單端孢(Trichthecium)、頭孢霉(Cephalosporium)、漆斑霉(Myrothecium)、輪枝孢(Verticillium)和黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrys)等屬的真菌產(chǎn)生[1]，該類毒素不僅污染小麥、大麥、玉米等禾谷類作物[2-6]，也危害馬鈴薯等經(jīng)濟作物[7-8]，以及肉、奶、蛋等畜產(chǎn)品[9-12]?，F(xiàn)已經(jīng)鑒定出單端孢霉烯族毒素200余種[13]，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為A、B、C、D四類，其中以A和B型較為常見[14]，A型在C8位上有羥基(—OH)或酯基(—COOR)，B型在C8位上有羰基(—C＝O)。具體結(jié)構(gòu)如圖1和表1所示[15]。由于單端孢霉烯族毒素具有致癌、致畸、致突變的作用，嚴(yán)重威脅人畜健康[16]。加之種類繁多，且結(jié)構(gòu)差異較大，故檢測方法多樣。另外，該類毒素的耐熱和耐酸堿特性，也導(dǎo)致了脫除的困難。本文就近年來谷物及其制品中重要的單端孢霉烯族類毒素的毒性效應(yīng)、分析及脫除方法進行綜述，以期為食品質(zhì)量的安全控制提供一定的理論依據(jù)。

圖1 單端孢酶烯族毒素的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of trichothecenes

表1 A型和B型單端孢霉烯毒素取代基的區(qū)別Table 1 Difference in substitution groups in trichothecenes

1 單端孢霉烯族毒素的毒性效應(yīng)

單端孢霉烯族毒素主要是通過抑制和干擾人和動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸合成，從而對人畜健康產(chǎn)生免疫抑制[17]。人畜在食用該類毒素污染的糧食及其制品后可產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。

1.1 對人類的毒性

在單端孢霉烯族毒素中，以T-2的毒性最強[18]，由于為親脂性物質(zhì)，極易滲透皮膚，低劑量時引起皮膚刺激，高劑量時能夠損傷細胞膜, 并引起淋巴腺和造血細胞組織的凋亡，同時還可導(dǎo)致骨髓壞死、白細胞減少和軟骨組織退行性變化等[19-20]。T-2還被認為與白細胞缺乏病、大骨病和克山病這3種地方病的發(fā)生有關(guān)[21]。 T-2對胎兒軟骨增殖有明顯的抑制作用，毒素濃度越大，對軟骨細胞的增殖抑制也就越明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達到20 g/L時就可引起軟骨細胞凋亡[22]。DON的毒性雖低于T-2，但其污染更為廣泛，攝取含DON的食物后會造成頭疼、惡心、腹疼、貧血、免疫力下降。如果長期攝入，會造成致癌、致畸、遺傳毒性、肝細胞毒性、中毒性腎損害、生殖紊亂、免疫抑制的發(fā)生[23]。

1.2 對動物的毒性

單端孢霉烯族毒素可引起動物惡心、嘔吐、食欲減退或拒食、倦怠和體質(zhì)量減輕、生殖功能下降，嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng)造成死亡[24]。不過，毒素的反應(yīng)強弱與動物種屬、年齡、雌雄和劑量等有關(guān)。一般豬對該類毒素較敏感，豬的抗拒綜合癥通常與DON有關(guān)。當(dāng)豬飼料中DON含量超過1mg/kg，采食量顯著降低，甚至拒食，偶爾伴有嘔吐癥狀，低劑量DON對豬毒性的作用機制主要是通過抑制免疫相關(guān)基因而導(dǎo)致一系列癥狀[25]。當(dāng)向豬飼料中添加12mg/kg DON時，會引起拒食，體質(zhì)量減輕，這種拒食可能是由于毒素對消化道的局部刺激或飼料的適口性不良所致[26]。DON毒素對牛、羊、成年雞鴨則不出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。牛、羊似乎對DON不敏感，可能是由于其瘤胃具有代謝和清除單端孢霉烯族毒素的能力[1]。當(dāng)雞采食含DON高達18mg/kg的飼料無明顯有害影響, 進食9.18mg/kg DON的飼料，蛋和肉中也檢測不出DON[27]。Iverson等[28]用DON含量為0、1、5、10mg/kg的飼料飼喂雄性、雌性大鼠2a發(fā)現(xiàn)動物體質(zhì)量增加與DON劑量呈負相關(guān)，雄性大鼠血漿中IgA、IgG濃度較對照組增高，生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)也可見明顯異常，病理學(xué)檢查還發(fā)現(xiàn)有肝臟腫瘤、肝臟損害。家禽、牛、羊、豬都對T-2 毒素敏感。T-2毒素經(jīng)動物口、皮膚、注射等方式都可引發(fā)造血、淋巴、胃腸組織以及皮膚的損害，并且損害生殖器官的功能，降低抗體、免疫球蛋白和其他體液因子的水平。Mono等[29]通過給大鼠飼喂含T-2的飼料時發(fā)現(xiàn)，雄鼠肺腺瘤和肝細胞腺瘤的發(fā)病率均高于雌鼠。而在妊娠9～10d的小鼠腹腔注射1.0mg/kg T-2(以小鼠體質(zhì)量計)，可導(dǎo)致鼠胎畸形，如短尾、無尾、脊柱融合等[30]。

2 單端孢霉烯族毒素的分析

2.1 樣品的提取與凈化

使用多種溶劑組合可充分從谷類及其制品中提取單端孢霉烯族毒素[31-32]，報道較多的提取劑是V乙腈:V水=84:16[3]，通過高速攪拌或機械攪拌可獲得最佳的萃取效果。樣品的凈化技術(shù)有柱色譜、固相萃取(SPE)、免疫親和柱(IAC)和多功能凈化柱(MycoSep)。最常用的是SPE技術(shù)，其中的固定相有硅膠、C18鍵合相、氧化鋁、活性炭、Flofisil的硅酸鎂、離子交換材料和它們的混合物。Seidel等[33]采用Florisil-SPE柱對谷物樣品進行前處理，結(jié)合氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)法對單端孢霉烯族毒素進行了測定，該方法對DON、NIV、HT-2回收率分別84.2%、87.1%、93.3%，而T-2的回收率比較低，僅為62.7%。IAC凈化技術(shù)具有特異性強、高選擇性和高回收率的特點，可以與高效液相色譜法聯(lián)用。因此，我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1771—2006《進出口糧谷中T-2毒素的測定》，免疫親和柱-液相色譜法中樣品的前處理采用的就是該法[34]。Cahill等[35]采用IAC對小麥樣品進行前處理，結(jié)合HPLC對DON含量進行檢測，平均回收率可達90%，RSD為8.3%。然而，IAC柱對待測毒素抗原有一一對應(yīng)的特異性吸附，測定費用昂貴。多功能MycoSep柱由于操作方便，無需固相提取和溶劑洗脫，經(jīng)MycoSep柱處理后幾乎所有的干擾物都留在柱中，而單端孢霉烯族毒素則不被吸附。MycoSepTM柱與HPLC和GC聯(lián)用，回收率大于80%(除NIV回收率60%～70%)[36]。Dall-Asta等[37]采用MycoSep 225柱凈化，用LC-MS聯(lián)用同時測定谷物中A型和B型單端孢霉烯族毒素，最低檢測限可達20ng/g。Valle-Algarra等[38]對MycoSep 225柱、Florisil-SPE柱、氧化鋁-活性炭-西萊特545混合柱、氧化鋁-活性炭柱、氧化鋁-活性炭-C18硅膠柱和氧化鋁-活性炭-硅膠柱這6種SPE柱對B型單端孢霉烯族毒素的凈化效果進行比較分析，通過回收率實驗發(fā)現(xiàn)MycoSep 225柱對DON的回收率最高，為89.6%。因此，MycoSepTM柱具有較好的應(yīng)用前景。最近，美國瓦里安公司新開發(fā)出了一種名為Bond Elut Mycotoxin的SPE柱，這種SPE柱采用了新型的吸附劑，可同時對谷物及制品中12種單端孢霉烯族毒素進行凈化，回收率可達65.1%，且該柱的市場價格比同類的MycoSep多功能柱和IAC要低很多[39]，但目前還未見有文獻報道使用。

2.2 樣品的檢測

目前單端孢霉烯族類毒素常采用的檢測方法基本上分為免疫學(xué)檢測和物理化學(xué)檢測兩大類。免疫學(xué)檢測主要為酶聯(lián)免疫法(ELISA)。物理化學(xué)檢測主要包括薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。

2.2.1 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測的優(yōu)點是快速、簡單、靈敏，待檢測的樣品通常不需要凈化，即使要凈化也是最低程度的。其缺點是較易出現(xiàn)假陽性，且要產(chǎn)生用于ELISA的高效、特異的單抗或多抗需要一個復(fù)雜的過程。我國衛(wèi)生部食檢所陽傳和等在1992年建立的DON的ELISA法最低檢出量為5ng/mL，檢測范圍為5～1000ng/mL，被批準(zhǔn)為國家推薦標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[40]。Ramesh等[41]將DON的C15羥基與牛血清白蛋白(BSA)形成的偶聯(lián)物作為抗原制備出的單抗進行ELISA檢測，檢測出DON和15-ADON，但不與3-ADON反應(yīng)，檢出限為0.05～20μg/mL。

2.2.2 物理化學(xué)檢測

2.2.2.1 薄層色譜法(TLC)

TLC是最早建立的一種單端孢霉烯族毒素檢測方法，具有簡便、經(jīng)濟、設(shè)備簡單等特點，但其靈敏度稍差，近年來應(yīng)用較少。對于谷物及其制品中DON和飼料中T-2的測定，TLC方法是我國國家標(biāo)準(zhǔn)推薦檢測方法之一[40,42]。Sokolovic等[43]采用TLC法對谷物和飼料中T-2和DAS進行了檢測，回收率分別為85%和90%，最低檢測線為0.1mg/g。隨著高效薄層色譜法(HPTLC)以及薄層掃描儀的應(yīng)用，TLC的分離效率和精確率都得到提高。但目前還未見有關(guān)使用HPTLC測定單端孢霉烯族毒素的文獻報道。

2.2.2.2 氣相色譜法(GC)

氣相色譜可與電子捕獲檢測器(ECD)、火焰離子化檢測器(FID)、質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用達到檢測的目的。Cerveró等[44]采用GC-FID，測定了25種谷物制品中DON和T-2的含量，回收率分別為67%～85%、85%～96%。Ibá ez-Vea等[45]建立了同時對A、B型單端孢霉烯族毒素進行快速分析的GC-MS，回收率為92.0%～101.9%，檢測限為0.31～3.87 g/kg。GC具有靈敏性、高選擇性、準(zhǔn)確性和精確性等優(yōu)點，可同時對A、B型單端孢霉烯族毒素進行檢測。但GC色譜法需要衍生，同時GC色譜中還存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不好、響應(yīng)漂移、上一次進樣樣品的滯留和記憶效應(yīng)、MS檢測時重復(fù)進樣變異系數(shù)大以及基體干擾等問題。所以應(yīng)用GC方法分析單端孢霉烯族毒素有待標(biāo)準(zhǔn)化以減少GC分析中出現(xiàn)的問題。

2.2.2.3 高效液相色譜法(HPLC)

HPLC具有GC所具有的靈敏性、高選擇性、準(zhǔn)確性和精確性等優(yōu)點，同時能克服GC中難以解決的問題，近年來被越來越廣泛使用。Schuhmacher等[46]建立了HPLCMS/MS測定玉米中A、B型單端孢霉烯族毒素的方法，該方法最低檢測限為0.3～3.8 g/kg。Han等[47]通過超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時檢測到5種DON，3-ADON、15-ADON、NIV、Fus-X的含量，檢測限0.29～0.99 g/kg，回收率88.5%～119.5%。Santini等[48]利用液相色譜/大氣壓化學(xué)源三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCAPCI-MS/MS)實現(xiàn)了對A、B單端孢霉烯族毒素NIV、DON、Fus-X、3-ADON、DAS、HT-2、T-2和NEO的同時檢測。除DAS、HT-2外，其他毒素的檢測范圍為0.2～3.3 g/kg。

表2對近年來上述單端孢霉烯族毒素的分析方法進行了總結(jié)，包括基質(zhì)來源、萃取、純化、分離檢測、檢出限和回收率等。可以看出，2005年以后基本都是利用HPLC-MS/MS方法進行單端孢霉烯族真菌毒素的檢測，主要是因為該方法不僅檢測限低，而且可以避免衍生步驟的煩瑣，便于操作。

表2 單端孢霉烯族毒素檢測方法Table 2 Detection of trichothecenes

3 單端孢霉烯族毒素的脫毒

單端孢霉烯族毒素的毒性取決于其分子結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)構(gòu)中的毒性官能團[42]。因此，這些官能團是脫毒作用的靶點。常見的脫毒方法有物理法、化學(xué)法和生物法。

3.1 物理法

物理法主要通過熱處理、微波、輻射、吸附等方法脫除毒素。單端孢霉烯族毒素類物質(zhì)在120℃時很穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于200℃時部分分解，Bullerman等[49]在210℃處理30～40min，可將其毒性結(jié)構(gòu)破壞，如焙烤類食品中，單端孢霉烯族毒素的含量會降低24%～71%。輻射法主要采用微波誘導(dǎo)或短波紫外線照射來降解毒素或殺死霉菌，Park等[50]采用自制的微波誘導(dǎo)氬等離子體處理含DON和NIV的谷物制品，當(dāng)處理5s后，DON和NIV可被徹底清除。Murata等[51]采用短波紫外線(中等強度0.1mW/cm2和高強度24mW/cm2)對含DON的樣品進行處理時發(fā)現(xiàn)，隨著紫外線強度的增強，以及處理時間的延長，對DON的脫除效果就會越來越好。

3.2 化學(xué)法

化學(xué)法是采用一定的化學(xué)試劑處理，將毒素轉(zhuǎn)化為低毒或無毒的物質(zhì)。主要包括堿、氧化劑和還原劑處理。Bretz等[52-53]發(fā)現(xiàn)，在75℃、0.1mol/L NaOH作用1h，NIV和3-ADON產(chǎn)生norNIVA、norNIV B、norNIV C、NIV內(nèi)酯和norDON A、norDON B、norDON C和其他4種產(chǎn)物(9-羥甲基DON內(nèi)酯、norDON D、norDON E和norDON F)，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的毒性遠低于NIV和3-ADON的毒性。氧化劑如臭氧進攻結(jié)構(gòu)中的C-9,10位的雙鍵使其發(fā)生環(huán)氧化而使其毒性降低。Young等[54]發(fā)現(xiàn)濕潤的臭氧(2.88%)通過霉變玉米時，能減少90%的DON；而當(dāng)兩者都處于干燥狀態(tài)時，DON的減少量不大。還原劑如Na2S2O5可將DON轉(zhuǎn)化成DON磺酸鹽，使其毒性大大降低。Danicke等[55]通過比較用Na2S2O5處理過的霉變小麥和不含毒素的小麥喂食仔豬，發(fā)現(xiàn)仔豬的反應(yīng)相同，與用未經(jīng)處理的霉變小麥喂食仔豬相比，具有很明顯的改善作用。

3.3 生物法

生物脫毒是指應(yīng)用微生物及其代謝產(chǎn)生的酶與毒素作用，使其分子結(jié)構(gòu)中的毒性基團被破壞而生成無毒降解產(chǎn)物的過程。單端孢霉烯族毒素的毒性各不相同，這是由其分子結(jié)構(gòu)，尤其是毒性官能團決定的。這些毒性官能團包括：C-12,13環(huán)氧環(huán)、C-9,10雙鍵、乙?；土u基的位置和數(shù)量也與毒性有關(guān)[15]。該類毒素的生物降解包括分子的脫環(huán)氧化、烯基的氧化、脫乙酰化、羥基化和羰基化等。

3.3.1 脫環(huán)氧化

在單端孢霉烯結(jié)構(gòu)中，C-12,13環(huán)氧環(huán)是毒性的必需官能基團，A型和B型單端孢霉烯族毒素的開環(huán)作用，例如脫環(huán)氧作用，能產(chǎn)生無毒或低毒的產(chǎn)物。如Swanson等[56]通過脫氧環(huán)T-2毒素刺激大鼠皮膚實驗，發(fā)現(xiàn)其毒性是T-2毒素的1/400。Schatzmayr等[57]從乳牛瘤胃液中分離得到具有脫環(huán)氧化作用的菌株BBSH 797。Eriksen[58]將DON在該菌株的存在下，經(jīng)脫環(huán)氧化得到DOM-1，進行DNA合成評價，發(fā)現(xiàn)DOM-1的毒性是DON的1/54，脫環(huán)氧NIV的毒性是NIV的1/55。

3.3.2 烯基的氧化

C-9,10雙鍵(烯基)也是單端孢霉烯族毒素毒性作用的必需基團。Young等[54]采用臭氧處理單端孢霉烯族毒素類化合物，首先攻擊雙鍵在C-9,10雙鍵上加上2個氧原子，分子的其他部分沒有發(fā)生改變。毒素的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使其毒性降低。

3.3.3 脫乙?；?/p>

雖然C-12,13環(huán)氧環(huán)和C-9,10雙鍵是毒性作用的必需基團，乙酰基的位置和數(shù)量也顯著地影響到單端孢霉烯族毒素的毒性。Fuchs[59]發(fā)現(xiàn)反芻動物瘤胃液中具有脫乙酰作用的微生物，在厭氧條件下與瘤胃液一起孵化后，DAS、T-2分別轉(zhuǎn)化為低毒性MAS、HT-2。Young等[60]發(fā)現(xiàn)從雞腸道消化物中分離鑒定得到細菌菌株LS100和SS3具有對12種單端孢霉烯族毒素脫毒降解的能力。Ueno等[61]也發(fā)現(xiàn)，土壤微生物短小桿菌屬菌株114-2在有氧條件下，可將T-2毒素可轉(zhuǎn)化為HT-2毒素，HT-2毒素進一步轉(zhuǎn)化成T-2三醇，T-2三醇在菌株BBSH797作用下，最后轉(zhuǎn)化為T-2四醇，其毒性大小關(guān)系：T-2＞HT-2＞T-2三醇＞T-2四醇。

3.3.4 羥基化和羰基化

單端孢霉烯族毒素分子結(jié)構(gòu)中，羥基的存在與否及位置也影響其毒性，NIV和DON的區(qū)別是NIV的C-4位上有羥基，而NIV毒性是DON的10倍[15]。但C-3位上羥基對其毒性影響不同，當(dāng)T-2、HT-2及T-2三醇的C-3位上的羥基被乙?；〈纬蒚-2乙酸鹽、T-2毒素和T-2四醇四乙酸鹽，它們的毒性卻顯著降低[62]。Baccharisspp.能將T-2毒素通過羥基化作用氧化成3’-OH T-2或3’-OHHT-2[63]，Yoshizawa等[64]研究表明，羥基化氧化作用需要NADPH的參與，主要發(fā)生在肝微粒體中，苯巴比妥能誘導(dǎo)大多數(shù)細胞色素P-450同工酶系，起到催化作用，從而加強這一反應(yīng)，苯巴比妥能在肝中通過羥基化和糖酯化作用被代謝掉。

4 結(jié) 語

通過對單端孢霉烯族毒素的毒性效應(yīng)、分析方法和脫毒技術(shù)進行系統(tǒng)比較，結(jié)果表明，該類毒素來源廣泛，對人畜健康存在潛在威脅，但不同畜種對單端孢霉烯族毒素的毒性反應(yīng)存在差異；多種方法可用于單端孢霉烯族毒素的檢測，包括酶聯(lián)免疫吸附法、HPTLC法、GC和HPLC法，其中HPLC-MS/MS由于具有極高的檢測靈敏度，可以根據(jù)待測物的性質(zhì)選擇不同的離子化模式，因此該法在單端孢霉烯族毒素的檢測中將具有廣闊的應(yīng)用前景；加熱和短波紫外線處理可有效降低單端孢霉烯族毒素的濃度，化學(xué)處理也有良好的脫除效果，但存在效果不穩(wěn)定、降低營養(yǎng)價值以及適口性、產(chǎn)生殘留有害物質(zhì)等問題，采用微生物的生物脫毒法因具有高效、特異性強、對飼料和環(huán)境無污染等特點成為目前研究的熱點。

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