表面增強(qiáng)拉曼散射標(biāo)記免疫檢測(cè)的再生性研究

祁妍華

拉曼光譜是在分子水平上研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要的工具，已廣泛應(yīng)用于分析科學(xué)領(lǐng)域[1]，表面增強(qiáng)拉曼光譜克服了普通拉曼光譜檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)[2]，是靈敏度較高的研究界面效應(yīng)的技術(shù)之一，能最大限度地應(yīng)用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行為、吸附界面表面狀態(tài)、生物大分子的界面取向及構(gòu)型、構(gòu)象和結(jié)構(gòu)分析[3]。在商品化的實(shí)際應(yīng)用中，需要強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品的可再生利用性，需采用真正可行的抗體抗原分離方式，同時(shí)不影響抗體抗原的活性與特異性[4]。

在以上理論的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在SERS檢測(cè)中引入合適的生物洗脫體系——甘氨酸-HCI緩沖體系，以探究本方法的洗脫效果、穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

1 材料與方法

1.1 材料 用Frens法制備得的金溶膠，粒徑大約30～40 nm。濃度1 mmol/L的苯硫酚和濃度1 mmol/L的4，4’-聯(lián)吡啶分子溶液。3.34 mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白（BSA）（5%p）。pH 9的硼砂緩沖溶液。美國(guó)Full Moon BioSystems公司的生物芯片。TBS/0.1%Tween、TBS和三次水。

1.2 方法

1.2.1 制備金溶膠作免疫標(biāo)記 用Frens法制備得到紫紅色渾濁的金溶膠，粒徑大約30～40 nm。將濃度1 mmol/L的苯硫酚1 μl和濃度1 mmol/L的4，4’-聯(lián)吡啶0.4 μl兩種標(biāo)記分子溶液分別加入金溶膠中做標(biāo)記，同時(shí)對(duì)標(biāo)記溶膠進(jìn)行多次離心，之后重新懸浮，以去掉多出來的標(biāo)記分子。把3.34 mg/L的羊抗人IgG 5 μl加進(jìn)標(biāo)記溶膠中，在室溫下充分反應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記溶膠再次離心，使其懸浮。選擇5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位進(jìn)行封閉，然后離心，在硼砂緩沖溶液（pH 9）的作用下，再實(shí)現(xiàn)溶膠的懸浮。

1.2.2 制作固相抗體 抗體使用的稀釋液是硼砂緩沖溶液（pH 9），稀釋的濃度以每毫升200～500 μg為宜，之后把稀釋好的液體滴在美國(guó)Full Moon BioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上，形成拉曼光譜的采集點(diǎn)。環(huán)境濕度維持65%～75%，把上面所制作好的芯片放入，12 h后拿出，然后放在普通室溫中，干燥0.5 h。

1.2.3 組裝三明治結(jié)構(gòu)的復(fù)合物和進(jìn)行SERS檢測(cè) 把之前制得的抗體分別在BSA溶液（5%）中、人抗原的緩沖溶液中和標(biāo)記免疫金溶膠溶液振蕩0.5 h、2～4 h和2 h，在每次震蕩后分別用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次沖洗，再分別用氮?dú)獯蹈?。制得“固相抗體-待測(cè)抗原-標(biāo)記免疫金溶膠”，它是三明治結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，可以用該抗體來進(jìn)行SERS檢測(cè)。

1.2.4 儀器 使用的儀器與設(shè)備有LEO-1530型掃描電子顯微鏡、法國(guó)Jobin Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射儀、He-Ne激光器、電荷耦合檢測(cè)器和100倍的長(zhǎng)焦鏡頭物鏡。

1.2.5 選擇洗脫體系 先用人抗原和羊抗人抗體制備抗原和抗體的復(fù)合物，第一次選擇強(qiáng)酸的鹽酸溶液（pH 2）進(jìn)行洗脫，讓基底在強(qiáng)酸溶液中震蕩，震蕩2 h，把4，4’-聯(lián)吡啶作為免疫標(biāo)記分子，第二次組裝三明治結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，用來進(jìn)行SERS檢測(cè)，觀察SERS譜圖。在看到生物緩沖體系的作用后，采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物緩沖體系，調(diào)節(jié)體系的pH 值，使pH為2，再把已制備好三明治夾心結(jié)構(gòu)的基底浸入其中。觀察洗脫之前、洗脫5 h、洗脫10 h、洗脫24 h后測(cè)得的SEM圖。

1.2.6 洗脫后基底的穩(wěn)定性 選擇羊抗人抗體抗原和苯硫酚，把后者作為標(biāo)記分子，制備抗原抗體復(fù)合物。然后再用用甘氨酸-HCI體系對(duì)復(fù)合物洗脫，分別在暗處放置在10 d、1個(gè)月、2個(gè)月后，第二次制備三明治結(jié)構(gòu)。分析經(jīng)過靜置再次組裝的三明治結(jié)構(gòu)SERS譜圖。

1.2.7 觀察載體的重復(fù)使用性 洗脫基底1、5、10次，再分別進(jìn)行組裝，第二次抗原檢測(cè)以苯硫酚作為免疫檢測(cè)標(biāo)記分子，通過分析之后的SEM圖來研究基底的可重復(fù)使用次數(shù)。

2 結(jié)果

首先通過改變pH值來試圖解離抗體抗原復(fù)合物，把洗脫2 h之后第二次組裝的三明治夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物進(jìn)行SERS檢測(cè)，譜圖上顯示有3個(gè)樣點(diǎn)有明顯的標(biāo)記分子信號(hào)。洗脫后預(yù)期目的已基本達(dá)到，但是在少部分區(qū)域出現(xiàn)與標(biāo)記分子4，4’-聯(lián)吡啶特征峰不一樣的雜峰和比較復(fù)雜的譜峰。該結(jié)果提示，只有強(qiáng)酸體系解離復(fù)合物并不利于維持生物環(huán)境。因此，分離的高選擇性和徹底性和保護(hù)體系生物活性的重要性是SERS檢測(cè)可再生性的關(guān)系因素，而使用生物緩沖體系后，既能防止pH變化對(duì)提取效果的影響，又能防止因pH值變化過度而導(dǎo)致的某些活性物質(zhì)的變性。

之后采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物緩沖體系進(jìn)行洗脫，通過洗脫之前、洗脫5 h、洗脫10 h、洗脫24 h后測(cè)得的SEM圖進(jìn)行分析得知，洗脫時(shí)間的選擇與抗體抗原分離的徹底性密切相關(guān)，且在洗脫時(shí)間為24 h時(shí)，抗原和抗體能充分分離，因此清除了抗體上的標(biāo)記免疫溶膠和抗原，洗脫效果較好。

把洗脫后的基底分別靜置在陰暗處10 d、1個(gè)月、2個(gè)月后，第二次制備抗原抗體復(fù)合物。通過分析處理后二次制備的復(fù)合物SERS譜圖，可見a1振動(dòng)模式特征譜峰在999和1 573 CTn-1的位置，而具有苯硫酚特征的峰值清晰。

洗脫基底重復(fù)1、5、10遍，然后再分別組裝，這一過程的SEM圖中，基底上的納米粒子和洗脫基底再組裝的次數(shù)呈反比，這與基底活性點(diǎn)被洗脫次數(shù)增加有關(guān)?；谏鲜鼋Y(jié)果，第二次抗原檢測(cè)以苯硫酚作為免疫檢測(cè)標(biāo)記分子，基底洗脫后再組裝的次數(shù)增加，可達(dá)10次左右。在這一過程的SERS譜圖上，挑選重復(fù)1、5、10次的譜圖，這些圖譜在1000～1600/cm處具有分辨率不良的、較復(fù)雜的雜質(zhì)峰。

3 討論

自從1974年Fleisehmarm發(fā)現(xiàn)吡啶的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜（SERS）以來，SERS已經(jīng)逐漸成為一種研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的快速有效的手段[5]。SERS標(biāo)記免疫檢測(cè)是將SERS與標(biāo)記免疫學(xué)相結(jié)合，利用SERS的高靈敏度和光譜選擇性，結(jié)合抗體抗原的特異反應(yīng)作用而進(jìn)行的納米標(biāo)記免疫分析技術(shù)[6]，能避免溶液中類似物質(zhì)的信號(hào)干擾，從而輕易獲取高分辨的表面分子信號(hào)[7]，由于具有高靈敏度、快捷、方便等特點(diǎn)[8]，SERS標(biāo)記免疫檢測(cè)已被廣泛用于表面科學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域，其應(yīng)用領(lǐng)域的有效拓寬直接與活性基底的制備和增強(qiáng)機(jī)理的研究密切相關(guān)[9]，SERS免疫檢測(cè)已逐漸有成為新的免疫技術(shù)的趨勢(shì)[10]。

本次研究中，對(duì)抗原抗體復(fù)合物采用的洗脫的方式選擇的是甘氨酸-HCl緩沖體系，在洗脫1 d后，抗原和抗體能充分分離，因此清除了抗體上的標(biāo)記免疫溶膠和抗原。優(yōu)良的再生效果體現(xiàn)在復(fù)合物在經(jīng)過重新組裝后，識(shí)別標(biāo)記分子從而進(jìn)行SERS檢測(cè)的能力不變，仍能使用的次數(shù)大約為10次。經(jīng)過本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過甘氨酸-HCI生物緩沖體系洗脫是一種洗脫基底再生效果好和穩(wěn)定性強(qiáng)的方法。

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