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    HIV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)量控制與管理

    2013-02-02 04:37:38羅曉璐黎建源蘇國(guó)生韋善求梁娟英
    中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2013年10期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)室血清檢測(cè)

    羅曉璐 黎建源 蘇國(guó)生 韋善求 梁娟英

    質(zhì)量控制(quality control),簡(jiǎn)稱質(zhì)控,是為了監(jiān)測(cè)和評(píng)估本實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量,以此來決定本實(shí)驗(yàn)各種檢驗(yàn)結(jié)果能否發(fā)出的檢查和控制手段。為達(dá)到規(guī)范或規(guī)定對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量要求而采取的作業(yè)技術(shù)和措施[1]。作為廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)的HIV初篩實(shí)驗(yàn)室,HIV抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制與管理顯得任務(wù)格外沉重,為了探討HIV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)量控制與管理情況。筆者總結(jié)了近年來在HIV初篩實(shí)驗(yàn)室管理工作中所遇到的相關(guān)質(zhì)量控制與管理問題,現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

    1 HIV抗體檢測(cè)的方法和程序

    1.1 篩查試劑 必須由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn),批批檢驗(yàn)合格、試劑均在有效期內(nèi)。使用經(jīng)過臨床質(zhì)量評(píng)估為敏感性和特異性都高的試劑。

    1.2 篩查方法 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA),采用第三代ELISA(雙抗原夾心法)。按照檢驗(yàn)?zāi)康倪x取符合標(biāo)準(zhǔn)要求的篩查試劑對(duì)臨床樣品進(jìn)行初篩檢測(cè)和復(fù)檢。

    1.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 試驗(yàn)開始前將試劑和樣品放置在室溫(18~23℃),做好試劑準(zhǔn)備。磷酸鹽緩沖液:若溶液中有結(jié)晶析出,應(yīng)將其置于37℃水浴箱中溫浴溶解,再用蒸餾水以1:25的稀釋倍數(shù)稀釋濃縮液,至4℃冰箱保存2周。TMB底物液在使用之前配制,TMB溶液和過氧化脲溶液按等量均勻混合。1 m硫酸終止液是將85 ml的蒸餾水中加入5 ml濃硫酸溶液中。待試劑盒、外部質(zhì)控血清及待檢標(biāo)本準(zhǔn)備好后,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作并做好各項(xiàng)質(zhì)控和安全防護(hù)要求進(jìn)行篩查檢測(cè)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)操作步驟 ①裝好所需使用數(shù)目的孔條,每孔均加入100 μl樣品稀釋液。設(shè)陰性對(duì)照孔3個(gè)和HIV-1陽(yáng)性對(duì)照孔1個(gè),還可增設(shè)HIV-2陽(yáng)性對(duì)照孔1個(gè)。②每孔各加加入待檢樣品及對(duì)照50 μl,未使用到的孔加滿樣品稀釋液以溶解結(jié)合物球,避免堵塞洗板機(jī)針孔。震搖15 s左右,于(37±2)℃水浴箱孵育(60±5)min。③置全自動(dòng)洗板機(jī)上洗滌6次(手工法將配好的洗滌液將反應(yīng)孔完全加滿,靜置30~60 s,甩掉孔內(nèi)洗液,在注滿,反復(fù)共洗滌6次,洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體,禁止在濾紙上拍干)。④每孔加入100 μl底物液,勿攪動(dòng),室溫避光孵育(30±2)min。⑤各孔加入1 m硫酸100 μl終止反應(yīng),震搖混勻。⑥置酶標(biāo)儀上讀數(shù),單波長(zhǎng)為450nm,雙波長(zhǎng)為450/630nm處讀取OD值。

    1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ①陰性對(duì)照(NC),HIV-1陽(yáng)性對(duì)照(PC1),HIV-2陽(yáng)性對(duì)照(PC2),NC必須 <0.25方可用,排除NC≥0.25的值,計(jì)算NC平均值。陰性對(duì)照范圍為0.6倍陰性對(duì)照均值<NC<1.4倍陰性對(duì)照均值。②符合PC1-NC均值≥0.4,PC2-NC均值 ≥0.4條件的NC可可以使用。③Cut off值 =陰性對(duì)照均值 +0.100,小于Cut off為陰性,大于或等于Cut off為陽(yáng)性。

    1.6 報(bào)告 對(duì)呈陰性反應(yīng)的樣品,可由實(shí)施檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報(bào)告;對(duì)呈陽(yáng)性反應(yīng)的樣品,須進(jìn)行復(fù)檢,不能出陽(yáng)性報(bào)告。

    1.7 復(fù)檢試驗(yàn) 對(duì)初篩呈陽(yáng)性反應(yīng)的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復(fù)檢測(cè)。當(dāng)兩種符合初篩標(biāo)準(zhǔn)要求的試劑復(fù)檢均為陰性,則可報(bào)報(bào)告HIV抗體陰性;如均呈陽(yáng)性反應(yīng),或一陰一陽(yáng),則送AIDS確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。

    2 HIV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)量控制與管理

    HIV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)量控制與管理必須符合《全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作規(guī)范》的要求[1],保證檢測(cè)質(zhì)量。做好艾滋病實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理,就要做到HIV抗體檢測(cè)的質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

    2.1 HIV抗體篩查的質(zhì)量控制與工作程序

    2.1.1 質(zhì)控血清的制備和保存 在每次實(shí)驗(yàn)中必須包含有內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清和外部對(duì)照質(zhì)控血清。內(nèi)部對(duì)照是質(zhì)量控制的基礎(chǔ),內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清來自試劑盒內(nèi)的陽(yáng)陰性對(duì)照。每一次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要使用同一批號(hào)試劑盒中中的內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清。外部對(duì)照質(zhì)控血清主要是為了監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性,同時(shí)觀察試劑盒批間或孔間的差異,外部對(duì)照質(zhì)控血清包括陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照血清。也可以只設(shè)置一個(gè)弱陽(yáng)性對(duì)照,濃度為該試劑盒臨界值(Cut-off)的2~3倍。

    2.1.2 外部對(duì)照質(zhì)控血清的制備 HIV抗體陽(yáng)性和陰性血清,56℃ 30 min滅活,3000 r/min,離心15 min。弱陽(yáng)性對(duì)照可取HIV抗體強(qiáng)陽(yáng)性血清用HIV抗體陰性血清梯度進(jìn)行稀釋并標(biāo)定后取得。按一年的用量進(jìn)行配制(也可加入一些不影響檢測(cè)結(jié)果的防腐劑)并取0.2 μm得濾膜過濾除菌。

    2.1.3 外部對(duì)照質(zhì)控血清的保存 按一周實(shí)驗(yàn)用量分裝、分類、標(biāo)記、封口、-20℃凍存于非自動(dòng)除霜冰箱中。外部對(duì)照血清禁止反復(fù)凍融,一旦融化后應(yīng)該存放在2~8℃冰箱內(nèi),僅供使用一周。

    2.1.4 外部對(duì)照質(zhì)控血清的使用 每一次實(shí)驗(yàn)必須使用外部對(duì)照質(zhì)控血清,以便監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。同時(shí)可以了解批間或孔間試劑盒的差異,以繪制質(zhì)控圖。

    2.1.5 外部對(duì)照質(zhì)控物的質(zhì)量要求 質(zhì)控物的管間或瓶間變異必須小于監(jiān)測(cè)系統(tǒng)預(yù)期的變異范圍(cv<20%),并且質(zhì)控物的成分應(yīng)在穩(wěn)定狀態(tài)下。質(zhì)控物應(yīng)無影響ELISA反應(yīng)的細(xì)菌和防腐劑。

    2.2 質(zhì)控圖的建立及應(yīng)用(以ELISA試驗(yàn)檢測(cè)HIV抗體為例)最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings質(zhì)控圖,使用累計(jì)和技術(shù)或趨勢(shì)分析技術(shù)的圖形可提供系統(tǒng)偏移和漂移的狀況。

    2.2.1 建立質(zhì)控圖參數(shù) 外部對(duì)照質(zhì)控物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)建立在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用方法對(duì)質(zhì)控物重復(fù)測(cè)定的基礎(chǔ)上。一般采用不同批次檢測(cè)20個(gè)數(shù)據(jù),僅做少量批次也至少做5個(gè)批次的檢測(cè),每個(gè)批次中不少于4個(gè)質(zhì)控物測(cè)定結(jié)果,以建立一個(gè)臨時(shí)性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,當(dāng)達(dá)到20批次數(shù)據(jù)后,替代臨時(shí)性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。算術(shù)平均值):是一組質(zhì)控血清S/CO值的平均值。統(tǒng)計(jì)學(xué)上采用至少20次(天)所測(cè)得的外部對(duì)照質(zhì)控S/CO值來結(jié)果計(jì)算出平均值。標(biāo)準(zhǔn)差(s):指樣品檢測(cè)值與均數(shù)之間的離散程度,是與對(duì)照血清S/CO均值有關(guān)的預(yù)期范圍。通常一組S/CO值的標(biāo)準(zhǔn)差以s表示。變異系數(shù)(cv):是反映各次S/CO值相對(duì)于均值離散程度的一個(gè)指標(biāo),可以用來衡量檢測(cè)的重復(fù)性或精密度??刂葡?主要是由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)質(zhì)控物檢測(cè)結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來劃定。例如12s質(zhì)控規(guī)則的控制限為外部對(duì)照S/CO平均值加減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差;13s質(zhì)控規(guī)則的控制限為外部對(duì)照S/CO平均值加減3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

    2.2.2 繪制質(zhì)控圖 質(zhì)控圖是把檢測(cè)數(shù)據(jù)與已確定的(計(jì)算出的)“控制限”進(jìn)行比較的圖,包含一條中心橫線和其上、下兩條平行的控制線,并按時(shí)間順序點(diǎn)入本實(shí)驗(yàn)室每次試驗(yàn)質(zhì)控血清的測(cè)定值。在常規(guī)條件下,對(duì)同一批質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)20次(天)或以上,收集一組S/CO值,求均數(shù))和標(biāo)準(zhǔn)差(s),超出2 s或3 s的數(shù)據(jù)不應(yīng)刪除。將質(zhì)控均值)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)分別標(biāo)注在質(zhì)控框架圖中。以S/CO值作縱座標(biāo)(Y軸),每一次(天)試驗(yàn)作橫座標(biāo)(x軸),繪制質(zhì)控圖。自第21次起,將各次質(zhì)控結(jié)果依次點(diǎn)入質(zhì)控框架圖中,以使檢驗(yàn)進(jìn)入質(zhì)控過程。

    2.3 質(zhì)控規(guī)則及使用 實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前必須評(píng)價(jià)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù),可通過圖形記錄的檢查或由計(jì)算機(jī)審核結(jié)果來決定。目前常用12s和13s質(zhì)控規(guī)則。告警(12s):指外部對(duì)照的S/CO值超出+2 s范圍,應(yīng)分析是否可以繼續(xù)檢測(cè)或進(jìn)一步觀察。由于12s做為失控標(biāo)準(zhǔn),會(huì)有較高的假失控概率,因此一般不采用。失控(13s):指外部對(duì)照的S/CO值超出+3 s范圍,判斷為失控。提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能被接受,可能跟系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或外部對(duì)照滴度下降有關(guān)。位移:主要指連續(xù)幾次(3~5次)外部對(duì)照S/CO值都落在質(zhì)控均值的同一側(cè)則,提示實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生一定的變化。趨勢(shì):指連續(xù)有幾次(5~7次)外部對(duì)照質(zhì)控S/CO值幾乎往一個(gè)方向分布,通常認(rèn)為是由參數(shù)的緩慢改變所引起。使用質(zhì)控規(guī)則來檢驗(yàn)隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差,使之成為檢出較高的分析誤差的能力,同時(shí)應(yīng)具有較低的假失控概率。采用多標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控方案來考察試驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性,而多規(guī)則的質(zhì)控方法能提高誤差的檢出率,并具有低的假失控概率。其要點(diǎn)為:質(zhì)控結(jié)果有一次落在2 s范圍意外,判斷為告警狀態(tài),值得注意,并觀察是否可以繼續(xù)檢測(cè)。出現(xiàn)下列情況時(shí),應(yīng)暫停檢測(cè)查找原因:出現(xiàn)一次3 s范圍的變化、連續(xù)兩次出現(xiàn)同一方向2 s范圍的變化、連續(xù)四次出現(xiàn)同一方向的1 s范圍的變化、連續(xù)10次結(jié)果都在1 s范圍內(nèi),但落在均值線的同一側(cè)。

    2.4 質(zhì)控圖的分析及失控處理 實(shí)驗(yàn)室需建立相應(yīng)的質(zhì)控圖析及失控處理程序。當(dāng)質(zhì)控已執(zhí)行時(shí),使用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來計(jì)算該項(xiàng)目的質(zhì)控限,將假失控概率降到最低。當(dāng)出現(xiàn)失控時(shí)進(jìn)行如重復(fù)質(zhì)控測(cè)定或重新分析新的質(zhì)控物不是最有效的方法,必須找出問題原因,找出解除故障的方法,并消除原因,防止將來出現(xiàn)同樣的問題。

    繪制和分析質(zhì)控圖的要點(diǎn):①要在常規(guī)條件下建立質(zhì)控圖參數(shù),用S/CO比值繪制質(zhì)控圖。對(duì)同一批質(zhì)控物連續(xù)測(cè)定得到20個(gè)數(shù)據(jù),求均值)和標(biāo)準(zhǔn)差(s),超出2 s或3 s的數(shù)據(jù)不應(yīng)刪除。②由專人負(fù)責(zé)建立質(zhì)控圖,每月定期召開質(zhì)控分析會(huì),討論本月的質(zhì)量控制情況。③建議長(zhǎng)期和穩(wěn)定地使用一種質(zhì)量好的試劑盒,更換不同廠家的試劑盒后,必須重新繪制質(zhì)控圖。④改用新批號(hào)試劑盒也應(yīng)重新制作質(zhì)控圖。使用不同批號(hào)、不同廠家的試劑盒需在質(zhì)控圖上標(biāo)注使用日期。發(fā)現(xiàn)失控,應(yīng)及時(shí)填寫報(bào)告單,上交負(fù)責(zé)人,分析失控原因并討論是否發(fā)出檢測(cè)報(bào)告結(jié)果。⑤使用新批次的外部對(duì)照質(zhì)控物時(shí),必須重新繪制質(zhì)控圖。⑥變異系數(shù)(cv)小于20%,表示外部對(duì)照處于穩(wěn)定狀態(tài)。

    3 討論

    為了保證HIV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可靠性,HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室需要建立一套規(guī)范的質(zhì)量管理體系,并擁有縝密的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)的計(jì)劃和措施[1-5]。設(shè)立儀器的維護(hù)保養(yǎng)及校準(zhǔn)制度,以保證儀器的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。滿足HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要并盡可能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成誤差的儀器設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)。主要有:酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、水浴箱、冰箱、溫濕度計(jì)、移液器等。各儀器設(shè)備的校準(zhǔn)方法按其相應(yīng)的校準(zhǔn)SOP進(jìn)行。儀器設(shè)備校準(zhǔn)后應(yīng)有校準(zhǔn)記錄,并保存于儀器管理檔案中。儀器設(shè)備每半年進(jìn)行一次校準(zhǔn)。儀器設(shè)備維修后需進(jìn)行校準(zhǔn),合格方可重新投入使用。每天核對(duì)酶標(biāo)讀數(shù)儀、洗板機(jī)濾光片的波長(zhǎng),檢查洗板機(jī)管道是否通暢及是否有漏液現(xiàn)象。每周需清潔儀器表面并保證光學(xué)零件不沾灰塵。每月檢查洗滌時(shí)各孔與對(duì)應(yīng)的沖洗頭是否對(duì)位良好,負(fù)壓是否符合工作要求。每年檢查清洗濾光片,出現(xiàn)破裂或霉點(diǎn)應(yīng)及時(shí)更換。根據(jù)儀器內(nèi)具有的校準(zhǔn)程序或使用校準(zhǔn)板,對(duì)濾光片的精密度進(jìn)行校準(zhǔn)并保留記錄。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)儀器出現(xiàn)異常情況,應(yīng)及時(shí)給予處理,必要時(shí)更換零部件。移液器1年至少應(yīng)該標(biāo)定1次,發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。標(biāo)定方法包括有色溶液光譜分析法、稱量校準(zhǔn)法、同位素計(jì)數(shù)法以及使用配套校準(zhǔn)盒等。多道移液器校準(zhǔn)須保證每一個(gè)加樣頭都能連續(xù)、準(zhǔn)確地加樣,移液器的精密度需在廠家出廠時(shí)規(guī)定的范圍內(nèi)。另外加強(qiáng)人員培訓(xùn)工作,工作人員必須持證上崗,建立一支具有高素質(zhì)、醫(yī)德好、技術(shù)精湛的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)團(tuán)隊(duì),還要不斷增加新技術(shù)人員[2-6]。只有這樣,做好HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)估,HIV初篩實(shí)驗(yàn)室管理才有可能落到實(shí)處。

    [1]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(2009年修訂版),2009:50.

    [2]王興金,張金元,吳學(xué)美,等.艾滋病抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制探討.中國(guó)中醫(yī)藥咨訊,2010,2(36):352.

    [3]高丹,吳旭.艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)室保證檢測(cè)質(zhì)量應(yīng)注意的問題.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(2):364,374.

    [4]朱豐秀,吳中發(fā).贛州市艾滋病網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制狀況評(píng)估.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(2):157-159.

    [5]喬恩發(fā),陳會(huì)超,楊莉,等.人類免疫缺陷病毒快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(21):2685-2686.

    [6]榮幸,張永旭,張海波.HIV篩查實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理.當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(1):37-38.

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