“溫陽補氣”針法對EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影響

王洪峰 吳 瑤 張立娜 (長春中醫(yī)藥大學研究生學院，吉林 長春 307)

“溫陽補氣”針法對EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影響

王洪峰 吳 瑤 張立娜1(長春中醫(yī)藥大學研究生學院，吉林 長春 130117)

目的 探討“溫陽補氣”針法對實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠血清中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達水平影響的作用機制和效果。方法 采用AChRα1 129-145多肽片段免疫接種雌性Lewis大鼠，建立EAMG大鼠動物模型;隨機選取建模成功的EAMG大鼠30只，分成針灸治療組、藥物對照組、模型對照組各10只，并將同期購進未建模的10只大鼠設為空白對照組;針灸治療組予以“溫陽補氣”針法治療，藥物對照組予以溴吡斯的明灌胃治療，其余兩組不予任何特殊處置，僅作對照觀察;治療結(jié)束后，從四組大鼠尾根靜脈采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定大鼠血清中TGF-β、TNF-α的含量。結(jié)果 治療結(jié)束后，針刺治療組EAMG大鼠血清中TNF-α的表達水平顯著降低，與模型對照組相比差異顯著(P＜0.05);TGF-β的表達水平明顯升高，與模型對照組相比差異顯著(P＜0.01)。結(jié)論 “溫陽補氣”針法治療MG的療效良好，可通過調(diào)節(jié)TNF-α和TGF-β的表達水平而發(fā)揮治療MG的作用。

針灸;實驗性自身免疫性重癥肌無力;TGF-β;TNF-α

重癥肌無力(MG)主要是由乙酰膽堿(Ach)受體(AchR)抗體(AchR-Ab)介導的細胞免疫依賴和補體參與的神經(jīng)肌接頭部位自身免疫性疾病。中醫(yī)學認為本病屬于“痿證”的范疇，筆者在臨床中以溫陽補氣為主要治療原則，采用針灸療法治療本病取得了良好的臨床療效。為進一步分析“溫陽補氣”針法治療MG的作用機制，本文探討“溫陽補氣”針法對實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性Lewis大鼠80只，6～8周齡，平均體重(162.21±4.7)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供〔合格證號碼:SCXK(滬)2007-0005〕，檢疫后送至長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心，標準大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 AchRα1 129-145多肽片段(美國Sigma公司)，大鼠 AChR-Ab 、TNF-α、TGF-β ELISA 檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司)，60 mg/片溴吡斯的明(上海三維制藥有限公司)，Σ960型全自動酶標儀(美國Metertech公司)，T-500型電子天平(美國雙杰兄弟集團有限公司)，GS-15R低溫高速離心機(美國Beckman公司)，微量加樣器(日本Nichiryo公司)，0.25×25 mm毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，艾絨(南陽綠瑩艾草生物制品有限公司)。

1.3 造模方法 選取SPF級Lewis大鼠60只，采用免疫接種法建立EAMG大鼠動物模型，將AChRα1 129-145多肽片段按照1∶2的比例與弗氏完全佐劑(CFA)完全乳化，配比按照200μl溶液內(nèi)含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)定容至20 ml，充分混勻制成免疫乳劑，取一滴乳劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散作為乳化好的標志。首次免疫接種時，將上述抗原乳劑以 300μl/只(含 AChRα1 129-145:75μg)多點注射于大鼠四肢足墊部、尾根部、背部。在首次免疫后第4、8周，分別進行強化免疫接種，將AChRα1 129-145多肽片段以1∶2的比例與弗氏不完全佐劑(IFA)完全乳化，配比按照200μl溶液含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的PBS液定容至 20 m l，以200 μl/只(含 AChRα1 129-145 50 μg)多點注射于大鼠四肢足墊部、尾根部、背部。以Lennon分級評分≥1分，同時AChR-Ab為陽性，視為EAMG大鼠模型造模成功。

1.4 分組及治療方法 選取建模成功的EAMG大鼠30只，隨機分成針灸治療組，藥物對照組，模型對照組各10只;此外，選取同期購進未建模的SPF級Lewis大鼠10只設為空白對照組。針灸治療組予以“溫陽補氣”針法治療，手三里(雙)直刺5 mm，足三里(雙)直刺6 mm，脾俞(雙)直刺6 mm，腎俞(雙)直刺6 mm，平補平瀉，針上加灸，30 min/次，1次/d，7次為 1個療程，療程間休息1 d，連續(xù)治療2個療程。藥物對照組予以溴吡斯的明灌胃治療，根據(jù)《藥理實驗方法學》計算出EAMG大鼠溴吡斯的明給藥量為18.5 mg/kg，將藥物溶于蒸餾水中，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)治療15 d。模型對照組和空白對照組，同等條件下飼養(yǎng)，抓取1次/d，觀察一般情況，不予特殊處置。

1.5 檢測方法 治療結(jié)束后，大鼠尾根靜脈采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清中TGF-β、TNF-α的含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用單因素多樣本均數(shù)比較。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 從首次免疫接種后，造模大鼠約在第4周之后逐漸開始出現(xiàn)癥狀，如活動減少、動作減緩、掙扎力量減弱、叫聲降低、毛發(fā)變暗等，在第2～3次強化免疫接種之后，上述癥狀逐漸加重。在造模過程中，共死亡大鼠3只，均因MG過重死亡。在首次免疫接種后的第9周，存活的57只大鼠中，共有31只大鼠Lennon評分≥1分，且AChR-Ab檢測為陽性。

2.2 “溫陽補氣”針法對EAMG大鼠血清TNF-α表達水平的影響 造模成功后，模型對照組大鼠血清中TNF-α的表達水平顯著升高，與空白對照組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。經(jīng)治療后，針灸治療組和藥物對照組大鼠血清中TNF-α的表達水平均明顯下降，針灸治療組與模型對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，藥物對照組與模型對照組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，但針灸治療組療效與藥物對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.3 “溫陽補氣”針法對EAMG大鼠血清TGF-β表達水平的影響 造模成功后，模型對照組EAMG大鼠血清中TGF-β的表達水平明顯降低，與空白對照組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。經(jīng)治療后，針灸治療組和藥物對照組EAMG大鼠血清中TGF-β的表達水平均明顯升高，與模型對照組相比均具有極顯著性差異(P＜0.01)，但針灸治療組療效與藥物對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β表達水平(±s，n=10)

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β表達水平(±s，n=10)

與模型對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別 TNF-α TGF-β空白對照組 49.976 5±9.891 51) 509.780 3±22.840 51)模型對照組 89.122 5±11.738 6 196.015 2±14.225 5針灸治療組 76.724 5±6.853 82) 424.007 6±35.471 61)藥物對照組 72.928 6±9.683 71) 438.037 9±41.029 81)

3 討論

干擾素、白介素(IL)、TNF-α、TGF-β等細胞因子都與MG的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。TGF包括TGF-α和TGF-β兩大類，TGF-β是一種重要的內(nèi)源性免疫抑制性因子，可以抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖和分化，抑制Th1、Th2細胞產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ、IL-4等，TGF-β可抑制AchR誘導炎性因子的產(chǎn)生，在MG的發(fā)病過程中具有重要的作用〔1〕。張栩等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，隨著MG患者病情的緩解和穩(wěn)定，其體內(nèi)內(nèi)源性免疫抑制功能得到增強，TGF-β在抑制MG及EAMG的發(fā)病和誘導免疫耐受中具有重要的作用。劉江恒等〔3〕在利用骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)治療EAMG大鼠時發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以通過TGF-β的分泌影響AChR特異性Th17/Treg細胞亞群的分布及其相關因子的分泌，證明TGF-β可以緩解EAMG大鼠的病情。TNF可分為TNF-α和TNF-β兩種，其中TNF-α常被稱為前炎癥性細胞因子，主要由單核-巨噬細胞分泌，具有促進胸腺細胞活化和增殖的作用，還可以促進IL-1、IL-2的產(chǎn)生，從而啟動Th1類細胞反應。有學者發(fā)現(xiàn)〔4，5〕MG患者早期血清中TNF-α的含量明顯升高，且病情越嚴重含量越高，治療效果越差;也有學者〔6〕發(fā)現(xiàn)MG患者在治療前血清TNF-α的水平與正常人無顯著差異，但患者體內(nèi)TNF-α的分泌功能處于待發(fā)或激動狀態(tài)，說明MG患者血清中TNF-α的表達水平雖然尚不能作為判斷MG病情的指標，但是TNF-α與MG的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關系。

“溫陽補氣”針法根據(jù)MG患者脾氣虛弱、腎陽不足的病機特點，以手三里、足三里、脾俞、腎俞為主要治療穴位，旨在溫陽補髓、益氣養(yǎng)血、濡潤宗筋，以達到補氣助力、壯肌治痿，對MG具有良好的治療作用。本研究結(jié)果說明TNF-α和TGF-β均參與了MG的發(fā)病過程，且具有重要的作用;另外針灸療法具有調(diào)節(jié)TNF-α和TGF-β的表達水平治療MG的作用，且其療效與藥物治療相近。由此可推斷:“溫陽補氣”針法對MG具有良好的治療作用，其作用機制與調(diào)節(jié)TGF、TNF等細胞因子的表達水平，改善自身免疫功能存在密切的關系。

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2 張 栩，孫兆林，叢志強，等.重癥肌無力病人外周血單個核細胞TGF-β及IL-6水平的測定〔J〕.青島大學醫(yī)學院學報，2003;39(4):386-8.

3 劉江恒，韓志娟，周明言，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β在骨髓間充質(zhì)干細胞治療實驗性自身免疫性重癥肌無力機制中的作用〔J〕.中國生物制品學雜志，2010;23(3):225-9.

4 張曉明，李新立，肖建軍，等.重癥肌無力病情與血清IL-6、TNF-α的關系〔J〕.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2008;11(11):25-7.

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The study of“warm ing yang and nourishing qi”acupuncture on the serum expression level of TGF-β and TNF-α of EAMG rats

WANG Hong-Feng，WU Yao，ZHANG Li-Na.
Graduate School，Changchun University of Chinese M edicine，Changchun 130117，Jilin，China

Objective To observe the influence of“warming yang and nourishing qi”acupuncture treatment on the serum expression levels of TGF-β and TNF-α of EAMG rats，and analyze themechanism.M ethods AChRα1 129-145 peptide fragmentswas used to immune Lewis female rats，establish EAMG ratmodels.The successful EAMGmodel ratswere divided into acupuncture treatment，drug control，model controlgroups，each group had 10 rats;the unmodelled 10 ratswhich were purchased at the same period were set to blank control group.The acupuncture treatment group was given“warming yang and nourishing qi”acupuncture treatment，the drug controlgroup was given pyridostigmine.After treatment，the serum expression levels of IL-12 and IL-18 were tested by ELISA.Results After treatment，the serum expression level of TNF-α was significantly reduced，and the level of TGF-β was increased in acupuncture treatment group than that of model control group(P ＜0.05，P ＜0.01).Conclusions The“warming yang and nourishing qi”acupuncture has good therapeutic effect through adjusting the expression levels of TNF-α and TGF-β.

Acupuncture;Experimental autoimmunemyasthenia gravis;TGF-β;TNF-α

R245

A

1005-9202(2013)23-5884-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.23.049

國家自然科學基金資助項目(No.81173344)

1 長春中醫(yī)藥大學針灸推拿學院

王洪峰(1971-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與效應機制研究。

〔2012-06-25收稿 2012-09-15修回〕

(編輯 袁左鳴)