QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測畜禽組織中金剛烷胺殘留

李彥，關(guān)麗麗，牟妍，孫磊麗，梁君妮，沙美蘭，鄒文曉，孫愛麗，曹鵬，*

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000；2.青島科技大學(xué)，山東青島264200）

金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥[1-2]，因其在體內(nèi)降解代謝的量極微，主要以原形隨體液排出，若長期食用殘留量高或被此類藥物污染的食品，會在人體內(nèi)積累易致蓄積中毒，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響[3-4]。金剛烷胺是國家明令禁止向食品中添加的禁用物，日本也于2013年2月15日發(fā)布通知，在進口食品監(jiān)控計劃中加入對中國產(chǎn)雞肉中金剛烷胺的檢查。但由于其藥理作用，國內(nèi)有部分商販將金剛烷胺用于雞、豬流感[5]的預(yù)防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。我國對于畜禽組織食品中金剛烷胺殘留含量未曾制定或立項過國家標準、行業(yè)標準，國際上也無特定限量要求及相應(yīng)檢測方法。為了保障人民飲食安全，有必要建立一種快速、準確、靈敏的方法對食品中金剛烷胺殘留含量進行檢測，同時其對于指導(dǎo)進出口食品中金剛烷胺含量控制，消除潛在的出口貿(mào)易障礙，具有緊迫的現(xiàn)實意義。

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Rugged，Safe）[6]，是由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades 教授等于2003年開發(fā)的，近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)[7-10]。由于該方法穩(wěn)定可靠、分析速度快，本文采用1%乙酸乙腈萃取、QuEChERS 法凈化、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測，建立畜禽組織食品中金剛烷胺殘留的分析方法，對雞肉、雞肝、豬肉、豬肝等畜禽組織食品進行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290UPLC-6490A 超高效液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent 公司；漩渦混合器VOATEX-2：Scientific Industries；SB5200 型超聲波清洗機：美國Branson 公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機：日本Hitachi 公司；氮吹濃縮儀：美國Organomation Associates 公司；分析天平：感量為0.1 mg：德國Sartorius公司。

金剛烷胺（Adamantanamine.1-（SG））：純度≥99%，ChromaDex Inc.；乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國Merk；無水硫酸鈉、冰乙酸為分析純；PSA（填料）、C18（填料）：粒徑40 μm，美國Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取2.00g 勻質(zhì)后的樣品，置于50 mL 帶螺旋蓋的聚丙烯離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，充分渦旋混勻，超聲提取25 min，搖勻后5 000 r/min 離心5 min，上清液待凈化。

1.2.2 凈化

將上述上清液轉(zhuǎn)移到凈化管中（10 g 無水硫酸鈉，400 mgC18，200 mgPSA），渦旋混勻，5 000 r/min 離心5 min。準確移取5.0 mL 上清液至具塞刻度試管，于45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL 定容液（30%乙腈水溶液含1%甲酸），超聲30 s，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待上機測定。

1.3 儀器參數(shù)與測定條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：Proshell120EC-C18，3.0×100mm，2.7μm；流動相：A：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液；B：乙腈；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫條件：0～2.0 min，90%～85%A；2.0 min～4.0 min，85%A；4.0 min～7.0 min，85%～70%A；7.0min～8.0min，70%～10%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；毛細管電壓為4.0 kV；源溫200 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣流速為11 L/min；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；監(jiān)測離子對及各優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 金剛烷胺的多反應(yīng)檢測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in MRM mode for amantadine

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

乙腈在有效提取目標物的同時具有沉淀蛋白的作用，且其帶出的弱極性成分少，反應(yīng)在質(zhì)譜上響應(yīng)高、基質(zhì)影響小，因而選用乙腈作為提取溶劑。金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中帶氨基，易溶于酸性試劑，在有機溶劑中添加一定比例的酸提取可顯著提高回收率[11-13]，故考慮向其中加入部分酸性溶液，本文考察了1%乙酸乙腈、3%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、3%甲酸乙腈4 種提取溶劑，進行回收率對照實，結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶劑對畜禽組織中金剛烷胺的回收率的影響Table 2 Effects on the recoveries of amantadine in livestock and poultry tissues with different extraction solvent

實驗結(jié)果表明，用1%乙酸乙腈溶液作提取劑，提取時間為25 min，回收率較高，因此選擇1%乙酸乙腈為提取液。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

PSA、C18 是QuEChERS 方法常用的吸附劑。采用PSA 可有效去除乙腈提取液中脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素等成分，C18 具有良好的除脂能力，根據(jù)提取液中殘留脂肪和水分的含量特點，通過實驗考查，見圖1，最終采用200 mg PSA、10 g 無水硫酸鈉及400 mg C18 為凈化劑組合進行分散固相萃取，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率較佳。

圖1 不同凈化條件對金剛烷胺回收率的影響Fig.1 Effects on the recoveries of amantadine with different purification conditions

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為維持流動相的低pH 保證金剛烷胺在流動相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，本文擬采用0.1%甲酸或乙酸來控制流動相的pH，試驗發(fā)現(xiàn)二者均可得到對稱、尖銳的峰形，但甲酸更利于金剛烷胺的離子化，可得到較高的檢測靈敏度，故實驗中選擇用0.1%甲酸控制流動相的pH，可以提高靈敏度，并且加入微量的NH4+可使峰型更尖銳、響應(yīng)更穩(wěn)定。最終本實驗選擇5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI 模式下對1.0 mg/L 的金剛烷胺標準溶液進行全掃描得到分子離子峰，再通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到子離子。金剛烷胺定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表2，在確定待測化合物監(jiān)測的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對各種待測化合物的噴霧電壓、毛細管溫度、鞘氣流速、電子管透鏡電壓、碰撞能量等條件進行優(yōu)化，結(jié)果如實驗部分所述。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

由于空白樣品基質(zhì)溶液于金剛烷胺標準品的保留時間處有基質(zhì)峰，本方法采用配制基質(zhì)匹配標準溶液的方法，很好的消除了基質(zhì)影響，完全能滿足殘留檢測的要求，見圖2。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

采用基質(zhì)加標標準工作曲線進行外標法定量，根據(jù)1.2 實驗方法處理空白樣品，用不同濃度標準品溶液進行定容、檢測，以峰面積和標準品濃度作圖，實驗表明，金剛烷胺在0.2 μg/L～100.0 μg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=14069.30×X，R2大于0.997。考慮到基質(zhì)的復(fù)雜性及信噪比要求，經(jīng)實驗數(shù)據(jù)確定本方法的檢出限（LOD）為0.6 μg/kg，定量限（LOQ）為2.0 μg/kg。

圖2 雞肝空白基質(zhì)和基質(zhì)中加入金剛烷胺的MRM 譜圖（2.0 μg/kg）Fig.2 MRM Chromatograms of blank chicken liver and spiked in blank sample with amantadine（2.0 μg/kg）

2.6 回收率和精密度

選取具有代表性的樣品基質(zhì)：雞肉、雞肝、豬肉、豬肝，分別添加2.0、4.0、20.0 μg/kg 3 個水平濃度進行添加回收試驗，每個水平測定6 次，采用外標法定量，計算回收率和精密度結(jié)果見表3。結(jié)果表明本方法的回收率范圍為70.5%～100.1%，RSD 值小于10%，本方法有良好的精密度和準確度，滿足分析要求。

表3 金剛烷胺的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of amantadine（n=6）

2.7 實際樣品測定

為驗證該方法的可靠性，從超市購買了雞肉、雞肝、雞蛋、豬肉、豬肝、豬肉干，6 種畜禽組織進行測定，同時作質(zhì)控樣品。樣品均未檢出金剛烷胺藥物殘留，質(zhì)控樣品的回收率等指標均達到分析要求，表明結(jié)果準確可靠。

3 結(jié)論

本文建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測金剛烷胺的方法。采用酸化乙腈溶液提取后進行分散固相萃取凈化，提高了提取效率，減少了雜質(zhì)干擾，快速簡潔。在優(yōu)化了提取和凈化方法的同時，采用配制基質(zhì)匹配標準溶液的方法，很好地消除了基質(zhì)影響，提高了檢測靈敏度，適用于禽畜組織中金剛烷胺定性、定量分析。

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