骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺中的分化研究

單毓強(qiáng)，羅 亮，金慧成@，吳 懿，蔡 陽，賈 忠，封光華

(1.杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2. 廣州中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510080)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺中的分化研究

單毓強(qiáng)1，羅 亮2，金慧成1@，吳 懿1，蔡 陽1，賈 忠1，封光華1

(1.杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2. 廣州中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510080)

目的：探討重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)大鼠胰腺中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells， MSCs)向內(nèi)皮細(xì)胞分化的實驗研究。方法將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、SAP組、MSC組、MSC加粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)組。檢測MSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率、血清白介素IL-10的濃度以及淀粉酶的含量。結(jié)果骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率上升，血清白介素IL-10的濃度升高，血清淀粉酶的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論重癥急性胰腺炎大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，修復(fù)胰腺損傷。加入粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，可提高M(jìn)SC向內(nèi)皮細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率。

重癥急性胰腺炎；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞

Abstract：[Objective] To investigate the bone marrow mesenchymal stem cells(MSC)converting to the endothelial cells for the severe acute pancreatitis(SAP)in rats. [Method] A total of forty rats were randomly separated to the SAP group(n=10), the normal group(n=10), the bone marrow MSC group(n=10), the bone marrow MSC and the granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)group(n=10). The conversion rates of the bone marrow mesenchymal stem cells, the expression of the interleukin-10(IL-10)and the contents of the amylases in serum were detected. [Result] The conversion rates of the bone marrow MSCs and the concentration of interleukin-10 in serum increased, furthermore, the contents of the amylases reduced. There were statistically differences(P<0.05). [Conclusion] The bone marrow MSCs can be significantly transformed into the endothelial cells in the progress of the severe acute pancreatitis. When adding the granulocyte colony-stimulating factor, the rates of conversion are strengthened than before.

Keywords: severe acute pancreatitis; mesenchymal stem cells; endothelial cells

本實驗通過研究在重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)損傷的胰腺內(nèi)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，深入探討MSC治療SAP的干細(xì)胞移植新方法。骨髓MSCs有多向分化潛能，在胰腺損傷時發(fā)揮再生和修復(fù)作用[1]。粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)屬于細(xì)胞生長因子，可以起到改善損傷胰腺微循環(huán)的作用[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道，MSC可用于治療肝損傷[3]、肺損傷[4]，但是MSC治療胰腺損傷的相關(guān)報道較少。本實驗采用SAP大鼠注射EDU標(biāo)記的MSC和G-CSF[5]，檢測MSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率、血清白介素IL-10的濃度以及淀粉酶的含量。研究在胰腺損傷時，MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制，有助于在制定SAP臨床治療方案時，發(fā)展新的干細(xì)胞替代治療方法，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 動物與試劑

年齡一致、狀態(tài)健康的雄性成年大鼠，體重200～250g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證：0096502；幼鼠，體重40～50g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證：0097319；L-精氨酸購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液購于齊魯制藥有限公司；IL-10 ELISA試劑盒購于Neo Bioscience公司；淀粉酶檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 培養(yǎng)MSC與標(biāo)記EDU

在造模前7天時，把幼鼠脫臼處死后，使用75%酒精進(jìn)行浸泡。在無菌的條件下，分離股骨，使用DMEM培養(yǎng)基把骨髓沖出，制成骨髓的單細(xì)胞懸液。取培養(yǎng)3代后的MSC調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。EDU標(biāo)記過程，采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，含0.5%Trion X-100的PBS中室溫進(jìn)行孵育，再加入1×Apollo工作液避光孵育，采用DAPI染核后，熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.3 動物分組及造模

將40只成年大鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只。正常組，常規(guī)飼養(yǎng)。SAP組，2次腹腔注射2g/kg 的L-精氨酸，間隔1h；造模成功12h后，經(jīng)尾靜脈注射PBS飼養(yǎng)。MSC組，造模成功12h后，經(jīng)尾靜脈注射1×106個/ml培養(yǎng)3代的MSC。MSC與G-CSF組，造模成功12h后，經(jīng)尾靜脈注射1×106個/ml培養(yǎng)3代的MSC；再在12h、24h、36h，分別經(jīng)尾靜脈注射40μg/kg的G-CSF。分組造模成功后，分別在第3天、第7天隨機(jī)處死每組5只大鼠，進(jìn)行解剖取胰腺組織并眼球取血。免疫熒光法檢測胰腺組織MSC的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，ELISA法檢測血清白介素IL-10的濃度，生化法檢測淀粉酶的含量。

1.4 檢測干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

分別在第3天、第7天隨機(jī)處死每組5只大鼠，進(jìn)行解剖取胰腺組織。將大鼠胰腺用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。使用二甲苯脫蠟，依次經(jīng)過100%、95%、85%、75%、50%乙醇，水。進(jìn)行抗原修復(fù)的過程，使用10%正常山羊血清封閉，一抗4℃孵育過夜。分別用熒光標(biāo)記二抗?jié)窈泻虳API濕盒，進(jìn)行室溫避光孵育?？篃晒獯銣鐒┓馄?，使用熒光顯微鏡觀察。免疫熒光法檢測血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)，vWF是內(nèi)皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物，vWF和EDU雙標(biāo)記細(xì)胞結(jié)果可用于分析MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，從而探討MSC修復(fù)SAP大鼠胰腺組織的機(jī)制。

1.5 檢測血清白介素IL-10濃度

反應(yīng)孔加入標(biāo)本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入標(biāo)準(zhǔn)品通用稀釋液。再向反應(yīng)孔加入生物素化抗體工作液，空白孔加入生物素化抗體稀釋液。避光室溫放置后，反應(yīng)孔加入酶結(jié)合物工作液，空白孔加入酶結(jié)合物稀釋液。使用酶標(biāo)儀檢測白介素IL-10的OD450值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計算白介素IL-10的濃度。

1.6 檢測血清淀粉酶含量

分別在第3天、第7天隨機(jī)處死每組5只大鼠，眼球取血，全血離心并分離血清，用于檢測血清淀粉酶含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間和組內(nèi)比較采用多重樣本獨立非參數(shù)檢驗和重復(fù)測量方差分析，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)MSC與標(biāo)記EDU

原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要有成纖維樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和圓形內(nèi)皮樣細(xì)胞。傳代培養(yǎng)后，可除去其他成份的細(xì)胞，使細(xì)胞成份逐漸純化。MSC分離培養(yǎng)初期，少量的貼壁細(xì)胞聚集生長。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞大量增殖，多數(shù)呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。細(xì)胞傳3代后，細(xì)胞形態(tài)均一，大多呈渦旋狀排列的細(xì)胞集落。紅色表示EDU標(biāo)記的核。

2.2 大鼠生長情況

正常組大鼠狀態(tài)尚可。手術(shù)組大鼠狀態(tài)欠佳，少量進(jìn)食，并排有黑便；注射處出現(xiàn)瘀黑，有毛發(fā)脫落。第3天處死每組5只大鼠，第7天處死每組剩余5只大鼠，解剖取胰腺組織并眼球取血。正常組大鼠無腹水，胰腺呈粉紅色，臟器無水腫壞死。SAP組大鼠有大量腹水，顏色晦暗，胰腺明顯充血、水腫、壞死，臟器粘連、腫脹、壞死。MSC組、MSC與G-CSF組大鼠有少量腹水，胰腺輕微充血水腫，臟器少見粘連壞死。

2.3 干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的檢測

熒光顯微鏡可見，SAP組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)不清，有明顯的炎性細(xì)胞浸潤。MSC組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)部分再建，可見小循環(huán)系統(tǒng)的管腔組織。免疫熒光檢測可知， MSC組vWF和EDU雙標(biāo)記細(xì)胞熒光計數(shù)平均每視野第3天為6個，第7天為7個；MSC與G-CSF組的vWF和EDU雙標(biāo)記細(xì)胞熒光計數(shù)平均每視野第3天為8個，第7天為12個；觀察數(shù)據(jù)服從泊松分布。MSC組vWF和EDU雙標(biāo)記細(xì)胞熒光計數(shù)均低于MSC與G-CSF組。實驗結(jié)果表明，MSC能修復(fù)SAP產(chǎn)生的胰腺損傷。加入粒細(xì)胞集落刺激因子后，發(fā)揮協(xié)同作用，能提高M(jìn)SC分化為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)MSC的修復(fù)作用。

2.4 血清淀粉酶含量的檢測

淀粉酶結(jié)果可知，正常組的淀粉酶含量低于SAP組(P=0.044)，MSC組的淀粉酶含量也低于SAP組(P=0.029)。MSC組的淀粉酶含量高于MSC與G-CSF組(P=0.045)。通過重復(fù)測量方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第3天到第7天，血清淀粉酶的含量逐漸下降，組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。實驗結(jié)果表明，加入MSC進(jìn)行治療后，炎癥反應(yīng)有所減輕，MSC可減輕SAP的炎癥反應(yīng)。加入G-CSF后，增加了抑制炎癥反應(yīng)的作用，增強(qiáng)了MSC的再生和修復(fù)作用。

2.5 血清白介素IL-10濃度的檢測

白介素IL-10結(jié)果可知，正常組的IL-10濃度高于SAP組(P=0.034)，MSC組的IL-10濃度也高于SAP組(P=0.028)。MSC與G-CSF組的IL-10濃度高于MSC組(P=0.041)。通過重復(fù)測量方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第3天到第7天，血清白介素IL-10的濃度逐漸上升，組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。實驗結(jié)果表明，加入MSC進(jìn)行治療后，保護(hù)性因子IL-10增多，導(dǎo)致炎性介質(zhì)減少，SAP導(dǎo)致的胰腺損傷逐步緩解，MSC修復(fù)胰腺的作用增強(qiáng)。加入G-CSF進(jìn)行治療后，G-CSF的促進(jìn)血管生成的作用，改善了胰腺的微循環(huán)，使修復(fù)作用得以加強(qiáng)(表1)。

3 討 論

有研究者認(rèn)為，在干細(xì)胞遷移因子和干細(xì)胞特異性生長因子的作用下[6]， MSC可遷移至SAP損傷的胰腺，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，再生和修復(fù)組織損傷。因此本實驗應(yīng)用MSC治療SAP產(chǎn)生的急性重度胰腺損傷，通過觀察胰腺中MSC轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞的情況，研究MSC治療SAP的內(nèi)在機(jī)制。MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率升高時， IL-10在免疫調(diào)節(jié)方面起保護(hù)性作用[7]。同時，在SAP導(dǎo)致胰腺損傷后，血清淀粉酶的含量增多。因此，在研究MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞治療胰腺損傷時，我們選擇IL-10和血清淀粉酶作為關(guān)鍵檢測指標(biāo)。從3天到7天的實驗觀察期內(nèi)，MSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率上升，血清白介素IL-10的濃度升高，血清淀粉酶的含量降低。說明SAP導(dǎo)致的胰腺急性炎癥得到控制，嚴(yán)重的臨床癥狀有所緩解。本實驗結(jié)果充分驗證了SAP由急性炎癥狀態(tài)到炎癥緩解狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)的改變，以及胰腺再生修復(fù)的過程。另外，加入G-CSF與MSC聯(lián)合進(jìn)行SAP治療，內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IL-10水平上升，淀粉酶水平下降，可見在應(yīng)用MSC修復(fù)胰腺損傷的同時，加入G-CSF，能起到協(xié)同作用，更加有利于胰腺的損傷修復(fù)[8]。本實驗在探討重癥急性胰腺炎大鼠胰腺，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的內(nèi)在機(jī)制方面，為重癥急性胰腺炎的臨床治療，提供了新思路、新方法[9]。應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞替代療法，有著廣闊的臨床應(yīng)用價值。

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SHANYuqiang1,LUOLiang2,JINHuicheng1@,WUYi1,CAIYang1,JIAZhong1,FENGGuanghua1

(1.The First People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310006, China; 2.The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University , Guangzhou 510080, China)

單毓強(qiáng)(1975-)，男，浙江東陽人，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：干細(xì)胞移植、胃腸腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究

金慧成 shang110117@163.com

R331.2

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1672-0024(2013)06-0039-04

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