干細胞在工程化組織構(gòu)建與再生中的應(yīng)用

呂靜靜 於學(xué)禪 沈秋霞 竺亞斌

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211)

引言

現(xiàn)在每年都有成千上萬的患者因各種疾病，導(dǎo)致組織和器官損傷或功能喪失，嚴重威脅著人們的身體健康，需要重建或移植。然而因為道德倫理、傳統(tǒng)思想以及自身再生能力薄弱、異體間存在免疫排斥等各種原因，在體外重建出緊缺的組織或器官已經(jīng)迫在眉睫。組織工程與再生醫(yī)學(xué)就是利用組織再生的各種方法和技術(shù)重建出結(jié)構(gòu)性和功能性的人工組織器官，以修復(fù)或更新受損、壞死組織器官的科學(xué)［1］。它為組織器官損傷或功能衰竭的患者們帶來了巨大的希望，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。成功構(gòu)建組織工程的三大要素是種子細胞、支架材料和三維構(gòu)建，其中最基本、最核心就是種子細胞的選擇。目前，種子細胞的來源很多，如自體細胞、同種異體細胞或異種細胞等。但是這些種子細胞有著自身難以克服的缺點，大大降低了其在組織工程中應(yīng)用的可行性，或者根本無法滿足人為構(gòu)建工程化組織器官的需要。如自體細胞來源數(shù)量有限，在短時間內(nèi)體外擴增困難，并常伴有去分化現(xiàn)象;同種異體或異種細胞容易引起病原體感染、具有免疫排斥等問題［2］。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞在一定條件下可以分化成人體幾乎所有的細胞［3-4］;成體干細胞如間充質(zhì)干細胞等同樣也具有分化成其他細胞或組織的潛能［5］。干細胞的這種定向分化潛能使其成為了比較理想的種子細胞。另外，干細胞具有很強的自我更新及定向分化能力，在細胞來源、增殖、定向分化及重建器官的植入等方面均具有較明顯的優(yōu)勢，在組織工程及臨床應(yīng)用上有著重要的應(yīng)用價值，因此干細胞是一種較為理想的種子細胞?，F(xiàn)在干細胞作為種子細胞在組織工程中的研究已然成為當前生命科學(xué)的焦點，為攻克困擾人們的各種疑難雜癥帶來了希望。干細胞包括胚胎干細胞和體細胞來源的干細胞，已經(jīng)用于組織工程構(gòu)建的干細胞種類有胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞等。本文結(jié)合國內(nèi)外最新研究進展綜述了胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞的基本情況和發(fā)展現(xiàn)狀，綜述了誘導(dǎo)多能干細胞作為組織工程研究的種子細胞的應(yīng)用和最新進展，同時總結(jié)了現(xiàn)在研究中存在的困難和問題，對于干細胞相關(guān)研究的深入開展和具體實施具有重要指導(dǎo)意義。

1 胚胎干細胞

胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)是在胚胎發(fā)育早期-囊胚(受精后約5 ～7 d)的內(nèi)細胞團中的細胞，能大量繁殖并保持未分化狀態(tài)，也可以分化成三個胚層中的任意一種細胞［4，6］，有著其他來源干細胞不可比擬的優(yōu)勢，也因此成為各種組織和器官修復(fù)中引人注目的種子細胞。1981 年，英國Evans、Kaufman 和美國Martin 建立了最早的小鼠胚胎干細胞系［7-8］。此后，一系列其他動物的胚胎干細胞系也相繼建立起來。體外分離獲取胚胎，培養(yǎng)“巢狀”生長的胚胎干細胞系已不再是困擾ESC 研究的難題，定向誘導(dǎo)分化為組織工程提供新的種子細胞則成為了新的研究熱點。

目前對ESC 向血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、肌細胞、角膜上皮細胞甚至神經(jīng)細胞等的體外分化已取得了可喜的成果，初步建立了一些體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)和體系，并發(fā)現(xiàn)了一些特異的誘導(dǎo)分化物質(zhì)。ESC 體外誘導(dǎo)分化為特定組織細胞常選用三種策略:EB(擬胚體)分化方式、與成熟細胞或成纖維飼養(yǎng)層共培養(yǎng)以及添加化學(xué)試劑等。2010 年，Nourse 采用 EB 方法，運用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進ESC 向血管內(nèi)皮細胞分化，而不受細胞密度的影響［9］。然而這一方法的分化效率較低，如內(nèi)皮細胞分化僅為1% ～3%［10］，向平滑肌細胞分化也只是10%［11］。此外，由EB 方法分化得到的血管細胞還摻雜許多其他類型的細胞。國內(nèi)研究者岳偉在此基礎(chǔ)上利用免疫磁珠(FACS)、流式細胞儀(MACS)等分選出Flk-1 陽性的血管前體細胞，然后在VEGF、血小板衍生生長因子(PDGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，得到了構(gòu)建成熟血管的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞［12］。最近一些可以提高血管細胞分化效率的改進EB 法被陸續(xù)報道，如:在細胞培養(yǎng)液中添加生長因子VEGF-A［9］或BMP4(骨形成蛋白)［13］，結(jié)合細胞外基質(zhì)環(huán)境作用［14］或者阻斷TGF - β 通路［15］等。此外，在培養(yǎng)板上包被膠原蛋白IV［16］、纖維黏連蛋白［17-18］也能不同程度地提高ESC 分化成血管細胞的產(chǎn)率和質(zhì)量。令人驚喜的是Kane 發(fā)明的一種無血清分化方式，使內(nèi)皮細胞的分化效率達到81. 59% ±2. 11%［19］，Blancas 證實纖維黏連蛋白比膠原蛋白IV 更有利于ESC 的分化［15］。

研究證實ESC 也可以誘導(dǎo)分化為包括心房肌、心室肌、竇房結(jié)樣細胞等多種心肌細胞。Gold 和Matsuura 等讓 ESC 在體外分別接受二甲亞砜(DMSO)、新霉素以及明膠的處理發(fā)現(xiàn)ESC 具有心肌細胞的典型特征:有節(jié)律的自發(fā)收縮，甚至有肌管的形成［20-21］。Mummery 等將ESC 與內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞(也叫VE-樣細胞)共培養(yǎng)也誘導(dǎo)出了心肌細胞［22］，這些充分證明了ESC 可以為心肌再生提供種子細胞。最近Sanford-Burnham 醫(yī)學(xué)研究所、人類生物大分子研究所和ChemRegen 公司的研究人員合成的ITD -1 分子十分有利于ESC 分化為心肌細胞，大大提高了ESC 誘導(dǎo)分化的效率［23］。

人ESC 在膠原蛋白Ⅳ和角膜緣成纖維細胞的作用下，可以成功誘導(dǎo)出類角膜緣上皮細胞并表達出角膜上皮細胞特異標志物CK13 及CK12，部分表現(xiàn)出上皮細胞的功能［24］。視黃酸(RA)誘導(dǎo)ESC向多種神經(jīng)細胞如神經(jīng)元分化［25］;胎牛血清促進ESC 向造血干細胞分化［26］;在BMP2 和BMP4 的作用下，ESC 也可以生成軟骨的主要細胞如軟骨形成細胞［27］。通過上述的研究成果進一步明確了ESC可以作為組織工程理想的種子細胞，參與下一步的器官再生與組織修復(fù)。

毫無疑問，人們對ESC 的定向誘導(dǎo)分化有了長足的認識，能夠創(chuàng)造出越來越多的具有寶貴價值的細胞應(yīng)用于臨床實踐。但是ESC 研究領(lǐng)域有許多我們現(xiàn)今無法解決的難題:體外培養(yǎng)要求嚴格，ESC向特定細胞分化的機制不明，體內(nèi)致瘤性高，臨床應(yīng)用面臨著法律、倫理和道德等問題，如果這些困難得以解決，ESC 將成為組織工程領(lǐng)域優(yōu)秀的“種子細胞庫”。

2 間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，因能分化為間質(zhì)組織而得名。與ESC 相比MSC 有著自己獨特的優(yōu)勢:(1)來源廣泛，遍布在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中;(2)能抑制免疫應(yīng)答，異體移植不會發(fā)生排斥反應(yīng)，移植成功率顯著增加;(3)具有造血支持、免疫調(diào)控和促干細胞植入的能力［28］;(4)連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。目前MSC 的分離方法主要有全骨髓直接貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法、免疫磁珠負篩選法等。大多數(shù)采用的是密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法或免疫磁珠負篩選法相結(jié)合的方法，獲得了純度較高的MSC［29］。

近年來的研究表明MSC 雖來源于中胚層，卻可以分化出多種內(nèi)胚層和外胚層組織細胞，如食管、骨、軟骨、脂肪、心肌、血管內(nèi)皮、神經(jīng)等多種組織細胞。食管黏膜損傷如對骨髓MSC 具有招募和趨化性，哈偉杰等將MSC 注射到食管損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSC 大多分布在食管粘膜下層和基層內(nèi)，可以形成食管主要細胞［30］。Tan 將復(fù)合MSC 的小腸粘膜下層支架原位替換部分犬食管，術(shù)后4 周發(fā)現(xiàn)縫合處上皮層幾乎全部形成，且有成束的骨骼肌細胞，毛細血管密布［31］。P?unescu 等用上皮生長因子、角質(zhì)細胞生長因子、干細胞生長因子、胰島素樣生長因子-II 成功的將MSC 誘導(dǎo)成了食管上皮細胞［32］。Sarosi 等將MSC 經(jīng)尾靜脈注射到用致死量光照輻射的大鼠體內(nèi)，10 d 后大鼠隨機地接受反流式食管炎手術(shù)及食管空腸吻合手術(shù)，8 周后傷口處呈現(xiàn)出鱗狀上皮細胞和柱狀上皮細胞［33］。zhang 等在PLGA 材料上種植基因修飾的MSC，植入體內(nèi)4周后，免疫熒光顯示部分 MSC 分化為平滑肌細胞［34］。

2010 年，張波等灌注培養(yǎng)接種在HA/PLA(羥基磷灰石接枝聚乳酸)納米復(fù)合多孔支架上的MSC，15 d 后檢測到骨組織ALP 活性明顯增強［35］。Partridge 等將轉(zhuǎn)染了Ad-BMP -2 的MSC 與多孔的PLGA(聚乳酸羥基乙酸)復(fù)合培養(yǎng)6 周后，經(jīng)礦化物、堿性磷酸酶檢測證實MSC 已向成骨細胞分化并且可以維持成骨細胞表型;將細胞支架復(fù)合物移入動物體內(nèi)也出現(xiàn)分化現(xiàn)象并產(chǎn)生了部分骨組織［36］。Gao 等將成軟骨條件誘導(dǎo)的大鼠骨髓MSC，復(fù)合透明質(zhì)酸或磷酸鈣的支架植入裸鼠背部皮下，一周后發(fā)現(xiàn)新生組織中含有Ⅰ、Ⅱ型膠原，認為骨髓MSC結(jié)合相應(yīng)的支架材料可以分化出軟骨細胞構(gòu)建人工軟骨［37］。Kang 等將復(fù)合聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA 支架的MSC 移植到大鼠的脊椎損傷模型中，發(fā)現(xiàn)MSC 利用三維支架可以修復(fù)脊椎橫切面的損傷［38］。Sekiya 等的實驗表明控制鎂離子濃度有效地促進滑液MSC 向軟骨細胞分化［39］。Hwang 等將復(fù)合在聚乳酸或丙交酯和ε-己內(nèi)酯共聚物的高分子支架材料上的脂肪MSC 與軟骨細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC 可以促進軟骨細胞的增殖速度和基質(zhì)形成，而具有軟骨細胞的微環(huán)境則能夠誘導(dǎo)MSC 向軟骨細胞定向分化［40］。

李春明等將脂肪MSC 與絲素蛋白支架復(fù)合物移植到Wistar 大鼠后肢肌肉，8 周后發(fā)現(xiàn)支架網(wǎng)內(nèi)成脂樣細胞明顯增多并融合片狀生長［41］。Cui 和他的同事們將MSC 與D1 細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)地塞米松可以誘導(dǎo)MSC 向脂肪細胞分化［42］。Neubauer 等將接種在PLG 支架上的大鼠MSC 置于含bFGF 的培養(yǎng)基中一段時間后，在支架材料上檢測到了高密度的脂肪細胞和氫化酶［43］。

Wang 等將DAPI 標記的鼠MSC 注入其他小鼠心肌中，術(shù)后檢測到MSC 向心肌細胞分化［44］。另外，Tang 和他的同事發(fā)現(xiàn)過量的旁分泌因子如SDF、VEGF、HGF 和IGF 促進MSC 向心肌細胞的分化［45］。Quevedo 和Hatzistergos 將MSC 注射到心肌缺損模型中，術(shù)后一段時間后發(fā)現(xiàn)MSC 遷移到了損傷部位，其邊界分化出了心肌細胞，并且提高了射血分數(shù)EF［46-47］。Shafy 等將MSC 種植到膠原蛋白包被的支架上，培養(yǎng)出了有節(jié)律跳動的心肌細胞，移植到體內(nèi)同樣提高了EF，同時增強了心肌的收縮功能以及抵御心室壁的病理性減?。?8］。

Ishii 等將用含脂質(zhì)體的磁性納米顆粒培養(yǎng)的MSC 注射到后肢缺血模型的裸鼠中，術(shù)后檢測到新生血管中含有血管內(nèi)皮生長因子，同時恢復(fù)了血液循環(huán)［49］。Silva 等將MSC 注射到犬心臟后，觀察到大量叢生的血管，免疫組化檢測到上皮細胞、內(nèi)皮細胞等標志性蛋白［50］。2008 年，Melero-Martin 將MSC 與血管內(nèi)皮祖細胞共培養(yǎng)，一周后MSC 誘導(dǎo)分化形成了大量的血管細胞［51］。

Choong 等發(fā)現(xiàn)MSC 可以遷移到角膜組織中形成具有角膜基質(zhì)細胞表型的細胞［52］。Chen 等將骨髓MSC 靜脈注射到腦損傷模型的實驗動物中，觀察到MSC 可以遷移至大腦，分化出神經(jīng)樣細胞［53］。Wang 等觀察到將MSC 復(fù)合到由羥基丁酸、羥基戊酸、羥基已酸三元共聚物的支架上可以促進向神經(jīng)細胞的分化［54］。MSC 還可以成功誘導(dǎo)出許多其他類型的細胞，移植到體內(nèi)分化出皮膚、肺等多種組織。這些研究結(jié)果揭示MSC 完全可能作為組織工程的種子細胞用于各種組織器官的構(gòu)建和功能修復(fù)。

可是目前將間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于臨床，仍有很多問題尚待解決:MSC 的分化進程與其增殖能力負相關(guān);MSC 來源不一，這些細胞的增殖、分化能力也大不相同，幾次傳代后，這種差異尤其明顯，無法滿足組織工程細胞數(shù)量的要求。

3 誘導(dǎo)多能干細胞

近些年的研究表明誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPS)是獲取組織工程種子細胞的另一新途徑，由于它不存在類似ESC 和MSC 的來源問題，成為了當前研究的熱點。iPS 的生物學(xué)特性、增殖特點及分化潛能類似胚胎干細胞，可以由單個細胞分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層所有的細胞，進而形成身體的所有組織和器官。2006 年Takahashi 將外源基因oct4、sox2、c-myc 和k1f4 導(dǎo)入皮膚成纖維細胞首次獲得了iPS，此成果被發(fā)表于當年的Nature 上［55］。此后不同研究小組將其他許多細胞如肺成纖維細胞、骨髓間質(zhì)細胞、血液B 淋巴細胞等重編程后都得到了iPS。2012 年，徐清波等在重編程人皮膚細胞時更是將iPS 的獲取時間縮短為4 d［56］。

由于iPS 細胞巨大的潛在應(yīng)用價值，研究者們紛紛看好，并在短時間內(nèi)已經(jīng)取得了一系列突破。如Margariti 等從iPS 培育出了血管細胞，并注入肢體缺血的模型實驗鼠中，形成了新的血管［56］。Lippmann 等將人iPS 和神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)于人工基底膜包被的培養(yǎng)板上誘導(dǎo)分化出了跨內(nèi)皮電阻達(1 450 ±140)Ω·cm2的血腦屏障內(nèi)皮細胞［57］。Nishimura 等將神經(jīng)細胞重編程的iPS 移植到小鼠耳內(nèi)，并成功發(fā)育成耳蝸毛細胞［58］。美國Herron 教授利用iPS 構(gòu)建了大量的類似于大多數(shù)人的靜息心率心肌細胞［59］。Duan 等將牙釉基質(zhì)衍生物和iPS 共同接種到牙周質(zhì)缺損處，發(fā)現(xiàn)新生的牙周膜連接牙槽骨和牙骨質(zhì)［60］。Bilousova 等將用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)的iPS 接種到明膠海綿支架上，并置于動物體內(nèi)形成了功能性的成骨細胞［61］。Xu 等發(fā)現(xiàn)用膠原酶處理的iPS 經(jīng)EB 分化模式可以容易地在接枝明膠的支架上誘導(dǎo)出成纖維樣細胞［62］。

此外，iPS 還可以分化出大量的其他功能性細胞如造血細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、骨骼肌細胞等多種組織特異性細胞，這些研究成果充分證明iPS 可以作為組織工程研究中較為理想的種子細胞來源之一。但是iPS 也存在著自身的問題:研究還不夠全面;長期生物安全性有待綜合評價;細胞來源不統(tǒng)一，與宿主的相容性尚待確定等。

4 問題與展望

大量的實驗研究證實干細胞在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為多種組織細胞，并且能夠修復(fù)損傷組織或促進器官再生。因此，干細胞作為組織工程的種子細胞有望從根本上解決器官移植中的諸多問題，從而治療臨床上的多種疑難雜癥。然而想要干細胞真正應(yīng)用于臨床實踐還有許多困難需要克服:ESC 面臨著法律、倫理和道德問題，體外培養(yǎng)要求嚴格，向特定細胞分化機制不明，容易在體內(nèi)致瘤;MSC 治療適應(yīng)癥、診療時機選擇和作用機制不明朗;iPS 研究不夠深入，生物安全性尚且不明。但是我們相信隨著各種干細胞和生長因子應(yīng)用等技術(shù)的成熟，這些問題的解決將指日可待。

我們課題組以鐵系化合物為催化劑合成了一系列聚乳酸基可生物降解的低毒聚合物-以聚羥基乙酸PGA、聚L-乳酸、聚己內(nèi)酯以及它們的共聚物為基材對其進行表面接枝改性，并運用熱致相分離、電紡絲、自制模具等技術(shù)，獲得了幾種具有良好生物相容性的食道組織工程三維支架［63-65］，目前正應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，進行深入的研究和探索，期待解決臨床上病變食管修復(fù)或再生的難題，從而最終實現(xiàn)實驗室生產(chǎn)食管組織器官的夢想，造福于人類。

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