紫莖澤蘭透皮劑的制備工藝優(yōu)化及其臨床殺螨效果觀察

王柳杰，房春林，古小彬，謝　躍，楊光友，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都611130； 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，四川 成都 611130)

動(dòng)物螨病是主要由疥螨科、癢螨科、蠕形螨科和皮刺螨科等螨類(lèi)寄生于動(dòng)物體表或表皮內(nèi)所引起的傳染性寄生蟲(chóng)病。螨病能夠引起動(dòng)物生產(chǎn)性能和產(chǎn)品質(zhì)量的下降，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致出現(xiàn)大量死亡[1]。化學(xué)類(lèi)殺螨藥物為目前國(guó)內(nèi)外防治動(dòng)物螨病的主力，包括有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑、有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑、除蟲(chóng)菊和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。這類(lèi)藥物雖然殺螨效果好，但存在毒性高、殘留時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)境污染大和長(zhǎng)期使用可產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題[2]。植物源的天然藥物具有對(duì)人畜低毒、對(duì)非靶標(biāo)生物比較安全、對(duì)環(huán)境壓力比較小，且不易產(chǎn)生殘留和耐藥性等特點(diǎn)[3-5]；因此，從天然植物中提取出高效、低毒、低殘留的殺螨物質(zhì)及有效殺螨活性成分，對(duì)動(dòng)物螨病的防控具有重要意義。

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)屬菊目菊科(Compositae)澤蘭屬(Eupatorim)多年生草本植物，原產(chǎn)美洲的墨西哥至哥斯達(dá)黎加一帶，它具有超凡的繁殖能力和密集成片取得種群優(yōu)勢(shì)的生物學(xué)特性。作為一種重要的外來(lái)有害入侵植物，已在我國(guó)重慶、四川、貴州、云南、西藏、廣西、河北、臺(tái)灣等地迅速傳播，給當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡帶來(lái)巨大威脅。近年來(lái)，隨著對(duì)紫莖澤蘭防控與利用研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭可作為開(kāi)發(fā)植物源性天然藥物的原料，不僅可以變害為寶，有效地控制這一有害雜草的蔓延，而且還能克服化學(xué)藥物的環(huán)境毒性、殘留和耐藥性等缺點(diǎn)。研究報(bào)道，紫莖澤蘭的提取物不僅可以用來(lái)殺滅蚜蟲(chóng)、抑制蛾蟲(chóng)產(chǎn)卵、治療二斑葉螨病和柑橘全爪螨病、殺滅倉(cāng)庫(kù)害蟲(chóng)等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)[6-9]，還可以用于治療動(dòng)物球蟲(chóng)病、線蟲(chóng)病、伊氏錐蟲(chóng)病等寄生蟲(chóng)病[10-12]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭的醇和醚提取物對(duì)危害動(dòng)物的蜱、疥螨、癢螨和足螨具有較好的殺蟲(chóng)活性[13-18]。為了進(jìn)一步對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行生產(chǎn)開(kāi)發(fā)利用，特開(kāi)展紫莖澤蘭源外用殺螨液提取工藝、制劑及臨床殺螨效果觀察與研究。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1供試動(dòng)物

自然感染螨病的家兔，即癢螨兔30只，雌雄各半；疥螨兔26只，雌雄各半；平均體質(zhì)量2.3 kg，購(gòu)自成都市都江堰某兔場(chǎng)。成年、健康、皮膚無(wú)損傷的清潔級(jí)家兔24只，雌雄各半，體質(zhì)量2.4～2.8 kg，購(gòu)自成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2015—030。

1.1.2供試植物及試劑

紫莖澤蘭2016年采自四川省攀枝花市。紫莖澤蘭素A(9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮，euptox A)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，純度95%，5 mg。99.7%無(wú)水乙醇，分析純；甲醇，色譜純；水，娃哈哈純凈水。

1.2　試驗(yàn)方法

以主要?dú)Ⅱ钚猿煞肿锨o澤蘭素A為考查指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考查因素，利用單因素試驗(yàn)確定因素水平，以L9(34)正交試驗(yàn)確定紫莖澤蘭乙醇提取的最佳工藝條件。

(1)紫莖澤蘭植株的處理。將采集來(lái)的紫莖澤蘭植株帶回四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究中心實(shí)驗(yàn)室自然陰干，為了進(jìn)一步烘干，把陰干后的植株放在50 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中至恒重，用粉碎機(jī)粉碎到50～200目，所得植物粉用密封袋密封，避光處保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。紫莖澤蘭素A標(biāo)準(zhǔn)品5 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行溶解，稀釋至刻度，搖勻作為母液，即配成溶液濃度為0.1 mg·mL-1的紫莖澤蘭素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

(3)樣品溶液的制備。精密稱(chēng)取粉碎的紫莖澤蘭植物粉末10.0 g置于500 mL圓底燒瓶中，加一定濃度和體積的乙醇溶液，利用冷凝回流裝置恒溫水浴一定時(shí)間，自然冷卻后經(jīng)2 770g離心5 min過(guò)濾，收集濾液之后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃水浴減壓蒸餾濃縮到50 mL，得生藥濃度為0.2 g·mL-1，備用。

(4)樣品中紫莖澤蘭素A含量的測(cè)定。測(cè)定樣品紫莖澤蘭素A含量的HPLC條件：流動(dòng)相為甲醇∶水=55∶45(體積比)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20.0 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm，190～400 nm波段全掃描，Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，柱溫 30 ℃。測(cè)定方法：分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋后的樣品溶液各20.0 μL，利用液相色譜儀測(cè)定。

1.3　單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響

取5份10.0 g的紫莖澤蘭植物粉末，放入圓底燒瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、65%、75%、85%、95%的乙醇150 mL，在98 ℃恒溫水浴下冷凝回流1 h，自然冷卻后，2 770g離心5 min過(guò)濾，把濾液收集到圓底燒瓶中，65 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾濃縮至50 mL。分別從中取200 μL用對(duì)應(yīng)濃度的乙醇稀釋3倍后進(jìn)樣，稀釋后的樣品按照1.2節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，提取率分別為0.114%、0.156%、0.174%、0.176%、0.187%。由此得知，紫莖澤蘭素A提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高。

1.3.2提取時(shí)間對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響

取4份10.0 g的紫莖澤蘭植物粉末，放入圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇150 mL，分別在98 ℃恒溫水浴下冷凝回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h。自然冷卻后，接下來(lái)的步驟同上。稀釋3倍后進(jìn)行測(cè)定，提取率分別為0.167%、0.172%、0.177%、0.188%。由此得知，紫莖澤蘭素A提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。

1.3.3料液比對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響

取4份10.0 g的紫莖澤蘭植物粉末，放入圓底燒瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇100 mL(料液比1∶10)、150 mL(料液比1∶15)、200 mL(料液比1∶20)、300 mL(料液比1∶30)。在98 ℃恒溫水浴下冷凝回流 1 h，自然冷卻后，同上操作，稀釋3倍后進(jìn)行測(cè)定，提取率分別為0.056%、0.094%、0.097%、0.110%。由此得知，紫莖澤蘭素A提取率隨著料液比的減小而升高。

1.3.4提取次數(shù)對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響

取3份10.0 g的紫莖澤蘭植物粉末，放入圓底燒瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇150 mL，在98 ℃恒溫水浴下分別冷凝回流1次、2次、3次，每次1 h。合并每次冷凝回流溶液自然冷卻后，同上操作，稀釋3倍后進(jìn)行測(cè)定，提取率分別為0.103%、0.114%、0.151%。由此得知，紫莖澤蘭素A提取率隨著提取次數(shù)的增加而升高。

1.4　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，從實(shí)際生產(chǎn)成本考慮，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表(表1)。

1.5　試驗(yàn)藥液制備

按照正交試驗(yàn)最佳提取工藝條件制得紫莖澤蘭的乙醇提取液，以制劑中是否加入促透劑氮酮(azone)來(lái)作為本次臨床殺螨效果的評(píng)估。依照初步篩選處方(5%氮酮、15%吐溫-80、50%丙三醇、30%酒精)對(duì)紫莖澤蘭植株乙醇提取液進(jìn)行溶解，在4 ℃冰箱中靜置48 h后過(guò)濾，制得生藥含量分別為1.0、0.5 g·mL-1(質(zhì)量體積比，下同)樣品液備用；不含氮酮組藥液以等體積0.9%生理鹽水代替氮酮進(jìn)行溶解，同樣方法在4 ℃冰箱中靜置48 h后過(guò)濾，制得生藥含量分別為1.0、0.5 g·mL-1樣品液備用。

1.6　皮膚安全性試驗(yàn)

1.6.1皮膚急性毒性試驗(yàn)

按照郝光榮[19]介紹的方法分組與處理。取皮膚無(wú)損傷、體質(zhì)量相近、健康狀況好的家兔12只，雌雄各半，隨機(jī)分成3組：A組，加氮酮1.0 g·mL-1；B組，未加氮酮；C組，空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)。在給藥之前的24 h，采用機(jī)械方法給家兔背部脊柱兩側(cè)10 cm×5 cm區(qū)域進(jìn)行對(duì)稱(chēng)剪毛，并且利用脫毛劑(8%硫化鈉)來(lái)脫毛。試驗(yàn)前注意檢查去過(guò)毛的皮膚是否完整，受傷了的皮膚不能用來(lái)做完整皮膚的試驗(yàn)。

表1L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

Table1Factor level design of L9 (34) orthogonal test

因素Factor水平1Level1水平2Level2水平3Level3A.乙醇體積分?jǐn)?shù)Volumepercentageofethanal/%808590B.料液比Ratioofmaterialtoliquid/(g·mL-1)1∶151∶201∶30C.時(shí)間Time/h1.01.52.0D.次數(shù)Times123

A、B組家兔給予相應(yīng)殺螨液3 mL·只-1，C組家兔給予0.9%生理鹽水3 mL·只-1。試驗(yàn)過(guò)程中，將藥物均勻涂擦家兔背部的脫毛區(qū)域，涂藥后區(qū)域立即用濕巾、消毒紗布和無(wú)刺激性膠布固定。停用藥之后的24 h，利用溫水洗去殘留的藥物，洗掉藥物之后1 h及1～7 d，每天觀察并且記錄家兔整體狀況，包括體質(zhì)量、四肢活動(dòng)、飲食與糞便、毛發(fā)、皮膚、呼吸、眼與黏膜等有沒(méi)有中毒的表現(xiàn)，以及死亡情況等。如果殺螨液完整皮膚組無(wú)毒性反應(yīng)，則用75%(體積分?jǐn)?shù))醫(yī)用酒精對(duì)家兔右側(cè)脫毛區(qū)域進(jìn)行消毒，用于制作破損皮膚，用16號(hào)滅菌針頭在消過(guò)毒的區(qū)域內(nèi)劃“#”，只損傷到表皮不損傷到真皮，以有少量血滲出來(lái)為度，馬上在破損皮膚部位涂擦殺螨液。具體操作方法、用藥劑量及觀察指標(biāo)同完整皮膚組，試驗(yàn)過(guò)程中要進(jìn)行3個(gè)組的相互對(duì)照比較。如果過(guò)程中有動(dòng)物出現(xiàn)死亡，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸體解剖檢查。當(dāng)存在肉眼觀察能見(jiàn)的病變時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行病理組織學(xué)相關(guān)檢查[20]。

1.6.2皮膚刺激性試驗(yàn)

依據(jù)參考文獻(xiàn)[21]進(jìn)行分組與處理。取試驗(yàn)家兔12只，雌雄各半，按照隨機(jī)數(shù)字將它們分為2組：第一組是完整皮膚組，第二組是破損皮膚組，每組6只，編號(hào)1～12來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。脫毛法同皮膚急性毒性試驗(yàn)。第2組家兔用酒精消毒后，在右側(cè)皮膚用滅菌16號(hào)針頭進(jìn)行“#”字劃

破，以皮膚有血滲出為度，破損的區(qū)域面積為5 cm×4 cm，劃痕之間的距離為0.5 cm。

采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法，每組家兔右側(cè)脫毛涂擦生藥含量為1.0 g·mL-1添加透皮劑殺螨液3 mL，作為對(duì)照，給予左側(cè)脫毛區(qū)涂擦0.9%生理鹽水3 mL，用濕巾、消毒紗布和無(wú)刺激性膠布固定，每天擦藥一次，連著擦藥5 d，在最后一次擦藥后24 h利用溫水洗去殘留的藥物，洗掉藥物之后1、24、48、72 h用肉眼觀察受藥部位的皮膚有沒(méi)有紅斑、水腫等情況。按照刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表2)，分別對(duì)完整皮膚和破損皮膚的刺激強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)：總分值0～0.49為無(wú)刺激；總分值0.50～2.99為輕刺激；總分值3.00～5.99為中刺激；總分值6.00～8.00為強(qiáng)刺激[22]。

1.7　臨床治療試驗(yàn)

參照Perrucci等[23]、Walton等[24]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

兔癢螨病組試驗(yàn)。將30只試驗(yàn)家兔隨機(jī)分成6組：4個(gè)外用殺螨液(涂擦)治療試驗(yàn)組分別為含紫莖澤蘭生藥1.0、0.5 g·mL-1加氮酮組和紫莖澤蘭生藥1.0 g·mL-1、0.5 g·mL-1未加氮酮組，每組試驗(yàn)動(dòng)物各6只；陽(yáng)性藥物對(duì)照組(含伊維菌素0.2 mg)，試驗(yàn)動(dòng)物3只；空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)，試驗(yàn)動(dòng)物3只。

兔疥螨病組試驗(yàn)。將26只試驗(yàn)家兔隨機(jī)分成6組，除外用殺螨液(涂擦)治療試驗(yàn)組每組動(dòng)物各5只外，其余動(dòng)物分組和處理均與兔癢螨病組相同。

伊維菌素，按照0.2 mg·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))皮下注射，每隔6 d一次，連用2次。藥液試驗(yàn)組：耳道采用滴入法，足爪患部先剪去被毛，棉花蘸取藥液涂擦；耳緣及嘴鼻等其他患部直接涂藥，每隔6 d一次，連用2次。生理鹽水組：直接用0.9%生理鹽水進(jìn)行涂擦，每隔6 d一次，連用2次。

表2皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Table2Parameters used to evaluate clinical response score of skin irritation intensity

紅斑Erythema分值Score水腫Edema分值Score無(wú)紅斑Noerythema0無(wú)水腫Noedema0勉強(qiáng)可見(jiàn)Barelyvisible1勉強(qiáng)可見(jiàn)Barelyvisible1中度紅斑M(jìn)oderateerythema2輕度可見(jiàn)(邊緣高出皮膚)Mildlyvisible(edgehigherthanskin)2嚴(yán)重紅斑Severeerythema3皮膚隆起約1mm,輪廓清晰可見(jiàn)Skinraisedabout1mmwithclearlyvisibleoutline3紫色紅斑伴有焦痂Purpleerythemawitheschar4水腫隆起1mm以上,范圍擴(kuò)大Edema(aboveskinfor1mm)withexpandedrange4

于試驗(yàn)開(kāi)始的第0、3、7、14、30天，收集痂皮，根據(jù)鏡檢螨的存在情況計(jì)算治愈率。顯微鏡觀察時(shí)，有螨蟲(chóng)顯示陽(yáng)性，沒(méi)有螨蟲(chóng)顯示陰性。按照相關(guān)文獻(xiàn)的方法[25-27]，計(jì)算每個(gè)治療組的治療效果(螨病治愈率)。

癢螨病組(左)和疥螨病組(右)療效等級(jí)評(píng)分判定見(jiàn)表3。

1.8　數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[28]。

2　結(jié)果與分析

2.1　紫莖澤蘭外用殺螨液提取工藝優(yōu)化

從表4可以得出，各因素對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響從高到低依次為A(提取濃度)>C(提取時(shí)間)>D(提取次數(shù))>B(料液比)，最佳工藝為A3B2C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶20(g·mL-1)，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)3次，提取率約為0.281%。

表3臨床評(píng)估感染程度與恢復(fù)描述等級(jí)評(píng)分

Table3Parameters used to evaluate score of clinical infection and recovery degree

癢螨組臨床感染與恢復(fù)程度的描述Infectionandrecoverydegreeinpsoroptesmitegroup病變?cè)u(píng)分Score疥螨組外耳緣感染與恢復(fù)程度的描述Infectionandrecoverydegreeofexternalearmarginsinscabiesmitegroup病變?cè)u(píng)分Score痂皮或螨蟲(chóng)都沒(méi)出現(xiàn)Nocrustormite0完全恢復(fù),無(wú)感染癥狀Fullyrecoveredwithnosymptomofinfection0耳道有刺激略發(fā)紅未發(fā)現(xiàn)螨蟲(chóng)Earcanalirritation,redness,nomites0.5皮膚干燥,紅化Dryingandreddeningskin1內(nèi)耳道有少量痂皮,少量螨蟲(chóng)Smallamountofcrustsandmitesininnerearcanal1具滲出物,開(kāi)始脫毛,開(kāi)始有痂皮Effusion,hairslipandcrusts2外耳道有痂皮,有螨存在Crustsandmitesexistedinexternalauditorycanal2滲出物多,脫毛較顯著,痂皮增多Moreeffusion,apparenthairslip,morecrusts3外耳道有痂皮且接近整個(gè)耳郭的1/4,有螨蟲(chóng)存在Crustsoccupiedabout1/4ofentireauricle,withmitesexis-ted3約1/2外耳緣覆蓋痂皮Crustscoveringabout1/2ofouterear4外耳道有痂皮且接近整個(gè)耳郭的1/2,有螨蟲(chóng)存在Crustsoccupiedabout1/2ofentireauricle,withmitesexis-ted4覆蓋的痂皮變厚,變多Thickerandenlargercrusts5外耳道有痂皮且接近整個(gè)耳郭的3/4,有螨蟲(chóng)存在Crustsoccupiedabout3/4ofentireauricle,withmitesexis-ted5幾乎整個(gè)外耳緣覆蓋大量痂皮Crustscoverednearlytheentireoutmarginofear6外耳及整個(gè)耳郭充滿痂皮,有螨蟲(chóng)存在Crustsandmitesexistedinouterearandentireauricle6

表4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table4Orthogonal test design and result

試驗(yàn)號(hào)TestNo.因素FactorsABCD紫莖澤蘭素A提取率ExtractionrateofeuptoxA/%111110.129212220.053313330.121421230.119522310.168623120.150731320.172832130.281933210.160K10.3030.4200.5600.457K20.4380.5020.3320.375K30.6130.4310.4610.521k10.1010.1400.1870.152k20.1460.1670.1110.125k30.2040.1440.1540.174極差Range(R)0.1030.0270.0760.049優(yōu)方案GooddesignA3B2C1D30.281

2.2　皮膚安全性試驗(yàn)

2.2.1皮膚急性毒性試驗(yàn)

在試驗(yàn)的14 d內(nèi)，與C組(對(duì)照組)相比，A組和B組在涂擦殺螨液后，完整皮膚組家兔四肢活動(dòng)自如，皮毛光澤正常，飲食、尿液和糞便、眼與黏膜、呼吸方面無(wú)明顯變化，精神狀況沒(méi)有不正常，也未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，更沒(méi)有發(fā)生死亡。破損皮膚組在試驗(yàn)的7 d之內(nèi)，A組和B組也未出現(xiàn)中毒癥狀，和C組相比，體質(zhì)量無(wú)顯著差異(P>0.05)(表5)。試驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，皮膚接觸此殺螨液并不會(huì)產(chǎn)生急性毒性作用。

2.2.2皮膚刺激性試驗(yàn)

完整皮膚組家兔涂擦透皮殺螨液后無(wú)任何異常出現(xiàn)，破損皮膚組涂擦透皮殺螨液后，給藥處有輕微紅斑，輕微水腫，為輕度刺激級(jí)別。但在洗去藥物72 h 后，紅斑及水腫現(xiàn)象消失，初步證明透皮殺螨液未對(duì)皮膚造成不可逆損傷。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析：紫莖澤蘭提取的殺螨液對(duì)完整皮膚家兔除在1 h內(nèi)有輕度刺激外，之后再無(wú)刺激性，而對(duì)于破損皮膚組則在 1～72 h為輕度刺激性，之后再無(wú)刺激性(表6、表7)。

2.3　臨床治療效果

2.3.1癢螨病組

從癢螨病組治療統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表8)可知，A組治療3 d，與其他藥液治療組相比治愈率有顯著(P<0.05)提升。治療7 d后，治愈率即達(dá)到100%。

2.3.2疥螨病組

從疥螨病組治療統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表9)可知，A組治療3、7 d，與其他藥液治療組相比治愈率有顯著(P<0.05)提升。治療7 d，治愈率即達(dá)100%。

3　討論

紫莖澤蘭的化學(xué)成分種類(lèi)很多，分離出來(lái)的化學(xué)成分已達(dá)100余種，主要為半萜類(lèi)、甾體類(lèi)、黃酮類(lèi)、單萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、三萜類(lèi)6大類(lèi)及其衍生物。利用紫莖澤蘭提取物進(jìn)行兔疥螨、兔癢螨、牛足螨、長(zhǎng)角血蜱(硬蜱科)的臨床試驗(yàn)，證實(shí)紫莖澤蘭粗提物對(duì)它們有極強(qiáng)的殺滅作用[13-18]，并成功地鑒別出了主要?dú)Ⅱ钚詥误w為9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮(紫莖澤蘭素A，Euptox A)。紫莖澤蘭素A對(duì)疥螨和癢螨的離體和在體殺滅都表現(xiàn)出很好的活性。對(duì)紫莖澤蘭素A在紫莖澤蘭體內(nèi)的分布及積累動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭葉片醇提物具有抑菌、抗病毒、殺蟲(chóng)活性。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選，明確了紫莖澤蘭倍半萜成分和以紫莖澤蘭素A為主的澤蘭酮衍生物是主要的殺蟲(chóng)活性成分[29-33]。選取紫莖澤蘭素A作為考查指標(biāo)對(duì)提取工藝進(jìn)行篩選，可以更好地反映提取物的殺螨活性。

表5皮膚急性毒性試驗(yàn)對(duì)家兔體質(zhì)量的影響

Table5Effect of acute toxicity test on rabbit body weight

kg

表6完整皮膚組刺激性試驗(yàn)結(jié)果

Table6Results of irritation test of complete skin group

動(dòng)物編號(hào)AnimalNo.性別Sex體質(zhì)量Bodyweight/kg給藥后時(shí)間Thetimeaftertreatment/h1樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS24樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS48樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS72樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS1♂2.60000000000000000000000002♀2.31120001010000000000000003♂2.51010000000000000000000004♀2.21120001010000000000000005♂2.70000000000000000000000006♀2.4101101000000000000000000總積分平均值Mean10.170.3300000刺激強(qiáng)度分級(jí)ScoreLSNSNSNSNSNSNSNS

Er，紅斑；Ed，水腫；TS，總分；♂，雄；♀，雌；LS，輕刺激；NS，無(wú)刺激。下同。

Er， Erythema; Ed， Edema; TS， Total score; ♂， Male; ♀， Female; LS， Light stimulation; NS， No stimulation. The same as below.

表7破損皮膚組刺激性試驗(yàn)結(jié)果

Table7Results of irritation test of damaged skin group

動(dòng)物編號(hào)AnimalNo.性別Sex體質(zhì)量Bodyweight/kg給藥后時(shí)間Thetimeaftertreatment/h1樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS24樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS48樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS72樣品SampleErEdTS對(duì)照ControlErEdTS7♂2.52240001120000000000000008♀2.21230001010000000000000009♂2.611200000000000000000000010♀2.311200010100000000000000011♂2.811200000000000000000000012♀2.4101101000000000000000000總積分平均值Mean2.330.170.6700000刺激強(qiáng)度分級(jí)ScoreLSNSLSNSNSNSNSNS

表8耳道感染與治療恢復(fù)后的評(píng)分等級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table8Clinical score of infection and degree of recovery for ears

時(shí)間Time/d組別GroupABCDEF03.50±0.18Aa3.58±0.15Aa3.55±0.16Aa3.38±0.15Aa3.43±0.14Aa3.17±0.11Aa31.48±0.05Cb1.77±0.06Bb1.78±0.06Bb1.97±0.02Bb2.12±0.05Bb2.72±0.10Aa70Cc0Cc0.18±0.03Bc0.32±0.04Bc0.27±0.05Bc3.02±0.10Aa140Bc0Bc0Bc0Bc0Bc3.08±0.09Aa300Bc0Bc0Bc0Bc0Bc3.10±0.04Aa

同行(列)數(shù)據(jù)后無(wú)相同大(小)寫(xiě)字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by different uppercase (lowercase letters) within the same row (column) indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

表9疥螨外耳緣部位感染與治療恢復(fù)后的評(píng)分等級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table9Clinical score of infection and degree of recovery of external ear margins in rabbits

時(shí)間Time/d組別GroupABCDEF03.90±0.14Aa4.02±0.16Aa3.92±0.13Aa3.94±0.12Aa4.10±0.10Aa4.33±0.09Ac31.36±0.05Db1.80±0.09Cb1.84±0.07Cb2.00±0.06Cb2.37±0.07Bb4.67±0.07Ab70Ec0.48±0.04Cc0.52±0.04Cc0.66±0.04Bc0.33±0.33Dc4.87±0.07Ab140Bc0Bc0Bc0Bc0Bc5.33±0.09Aa300Bc0Bc0Bc0Bc0Bc5.60±0.10Aa

以往利用高效液相色譜法測(cè)定紫莖澤蘭提取液中紫莖澤蘭素A含量的研究報(bào)道[30，32-33]中，對(duì)于流動(dòng)相的配比沒(méi)有統(tǒng)一明確的結(jié)果。本試驗(yàn)在1.0 mL·min-1流速下，對(duì)甲醇∶水(體積比)分別為60∶40、55∶45、50∶50情況下的流動(dòng)相進(jìn)行了考查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中甲醇∶水(體積比)=55∶45、流速1.0 mL·min-1洗脫時(shí)，色譜峰分離較好，峰形對(duì)稱(chēng)較好，基線平穩(wěn)，且出峰時(shí)間合適。

本研究還對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考查。在紫莖澤蘭殺蟲(chóng)活性的提取溶劑研究中，采用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等的報(bào)道很多[30，34]，其中，乙醇提取最常見(jiàn)。從生產(chǎn)成本低和提取溶劑安全性等方面考慮，用乙醇進(jìn)行提取最合理。從正交試驗(yàn)結(jié)果可知，采用乙醇回流法對(duì)紫莖澤蘭中殺螨活性成分進(jìn)行提取，提取濃度和提取時(shí)間對(duì)紫莖澤蘭素A提取率的影響較大，提取次數(shù)和料液比的影響相對(duì)較小。以紫莖澤蘭素A為指標(biāo)，采用回流提取方法對(duì)紫莖澤蘭外用殺螨液進(jìn)行提取的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶20(g·mL-1)，每次提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)3次，考查指標(biāo)提取率為0.281%。該工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可行。

螨類(lèi)寄生于動(dòng)物的皮膚表面、表皮及毛囊與皮脂腺內(nèi)，經(jīng)皮給藥途徑是動(dòng)物螨病的治療方式之一。氮酮是目前公認(rèn)的一種較好的透皮吸收促透劑，它的使用濃度低、促透效果好、無(wú)毒、無(wú)刺激，能促進(jìn)大多數(shù)疏水性和親水性化合物的透皮吸收。它主要通過(guò)加速角質(zhì)層類(lèi)脂流動(dòng)和溶解皮膚的類(lèi)脂增加藥物透皮吸收，被廣泛應(yīng)用于外用制劑研究中[35-38]。本試驗(yàn)首次在紫莖澤蘭的乙醇提取液中加入透皮制劑氮酮，并進(jìn)行臨床殺螨對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，加入氮酮組的臨床治療效果優(yōu)于未加氮酮組，并且在用藥第3天加氮酮高劑量組(A組)不論是兔癢螨病還是兔疥螨病，治療效果均比其他組好，試驗(yàn)結(jié)果差異顯著。本研究中，皮膚刺激和毒性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，氮酮對(duì)家兔沒(méi)有造成任何危害，尤其是臨床殺螨效果最好的加氮酮高劑量組，對(duì)完整皮膚組的靶動(dòng)物也沒(méi)有表現(xiàn)出危害，在破損皮膚組中，外用殺螨液對(duì)靶動(dòng)物有輕度的刺激作用，但也只是在72 h內(nèi)，72 h之后刺激逐漸消失，并且殺螨液也沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)破損皮膚組靶動(dòng)物的毒性作用，更沒(méi)有引起破損皮膚因細(xì)菌感染引起的膿腫等現(xiàn)象。

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