瀕危藥用植物平貝母的研究進(jìn)展

王長(zhǎng)寶，徐增奇，王 仲，張海軍，楊洪升

平貝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)是百合科多年生草本植物，與川貝母(F.cirrhosa)、浙貝母(F.thunbergii)“三分天下”，為中國(guó)藥典收載品種［1］，也是我國(guó)東北特產(chǎn)藥材之一［2］。其味苦，性寒。歸肺、心經(jīng)。功效清熱化痰，潤(rùn)肺止咳，開郁散結(jié)。用于治療肺熱咳嗽，久咳痰喘，心胸郁結(jié)，煩熱吐血，肺炎、支氣管炎等癥。由于野生平貝母大多在山林蔭蔽條件下，其生長(zhǎng)地區(qū)的林木不斷受到砍伐，自然植被遭受破壞，加之不斷采挖和放牧等人為活動(dòng)影響，野生資源逐漸減少［3］。1984年頒布的中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄(第一冊(cè))將其定為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。本文對(duì)平貝母的生物學(xué)特性、化學(xué)成分、繁殖方法、傳粉生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)行了綜述，為今后深入研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 生物學(xué)特性

平貝母植株長(zhǎng)可達(dá)1 m。鱗莖由2枚鱗片組成，直徑1～1.5 cm;葉輪生或?qū)ι?先端不卷曲或稍卷曲?；?～3朵，紫色而具黃色小方格，頂端的花具4～6枚葉狀苞片;雄蕊6枚，花藥近基著，花絲具小乳突;花柱也有乳突;花期5～6月。蒴果倒卵形，具6圓棱、3室、頂裂;內(nèi)含100～150粒種子。種子扁平，半圓形至三角形，黃綠色［4］。平貝母是一種早春植物，喜涼爽濕潤(rùn)氣候，怕干旱炎熱。早春化凍即萌發(fā)出土，地溫在2～4℃時(shí)開始抽莖，13～16℃時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)盛期。平貝母生育期極短，(從出苗到枯萎只有60天左右)，生長(zhǎng)發(fā)育迅速(春季4月上旬至6月中旬即可完成一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程，秋季8月上旬至10月上旬完成更新芽的分化)，每年在較涼爽的春秋二季生長(zhǎng)，在酷熱的夏天和寒冷的冬季休眠［5－6］。平貝母從種子播種到開花結(jié)果成株形成，需4～6年時(shí)間，其幼苗與成株形態(tài)有顯著不同?？煞譃?線形葉時(shí)期、雞舌頭葉時(shí)期、四平頭時(shí)期、燈籠竿時(shí)期［7－8］。平貝母分布地域較廣，東北三省均有零散分布，主要分布于長(zhǎng)白山延脈，123°～135°E，40°～48°N范圍內(nèi)濕潤(rùn)的山腳坡地闊葉林下，山地灌木林帶及林間空地。海拔多在800 m以下。產(chǎn)地氣候寒冷，年平均氣溫2～5℃，1月份平均氣溫－17～－20℃，7月份平均氣溫為20～23℃，溫度年較差為40℃左右;終霜期五月中、下旬，初霜期9月中、下旬，無霜期110～120 d左右;年平均降水量750～1 000 mm，多集中七、八、九3個(gè)月。平貝母多生長(zhǎng)在上層較厚、質(zhì)地疏松、結(jié)構(gòu)良好、富含腐殖質(zhì)的棕色森林土或山地黑鈣土，土壤含水量多在20%～30%左右。

2 化學(xué)成分

由于平貝母具有較強(qiáng)的生物活性和較高的應(yīng)用價(jià)值，因此，化學(xué)成分方面的研究較多，并探索出許多有效的提取和測(cè)定方法，如滴定法、薄層色帶法、分光光度法、高效液相色帶法、氣相色帶法等，從中分離并鑒定出130多種天然化合物，主要為生物堿、生物堿苷及多糖成分［9－14］。

生物堿是平貝母最主要的次生代謝產(chǎn)物，我國(guó)學(xué)者朱子清從1932年開始研究貝母屬生物堿骨架結(jié)構(gòu)，經(jīng)過20多年的努力工作取得了很大進(jìn)展，溝通了貝母屬生物堿和藜蘆屬生物堿的關(guān)系，確定了貝母生物堿的骨架。1956年，陸仁榮等從平貝母中分得一針狀結(jié)晶，與貝母堿混合熔點(diǎn)不降低，從此引起人們才對(duì)研究平貝母化學(xué)成分重視［15］。1982年，徐東銘等從平貝母中分離和鑒定出6個(gè)化合物，即西貝素、貝母辛、平貝堿甲、平貝堿乙、西貝素苷和平貝堿苷［16］。崔東濱等從平貝母莖葉中分得貝母辛、平貝堿甲和貝母甲素、平貝定苷、平貝堿乙、平貝堿丙和平貝寧苷、腺嘌呤核苷、半乳糖醇和琥珀酸等［17］。Kitamura先后從平貝母中分離出6種生物堿:烏蘇里寧、烏蘇里啶、烏蘇里啶酮、烏蘇里酮、平貝酮和平貝堿［18－21］。1996年，陳澤乃等從平貝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分，試驗(yàn)表明腺苷為抑制血小板聚集的主要成分，并認(rèn)為核苷類可能是貝母中除生物堿外的另一類重要活性成分［22］。1997年，徐汝明等利用甲醇提取幾種貝母，以層析法粗分離并用紫外分光光法測(cè)定其中核苷類化合物的種類和含量。研究結(jié)果表明平貝母中含有較高含量的腺苷及低含量的胸苷［23］。2008年，韓成花等從平貝母氯仿－乙酸乙酯提取物種分離并鑒定出棕櫚酸、β－谷甾醇和曼陀羅3種單體化合物［24］。2011年，劉春紅等采用乙醇沉淀、DEAE－纖維素離子交換層析和Sepharose CL－6B凝膠過濾層析法，從平貝水提取液中分離純化得到水溶性多糖，命名為FUP－1。通過紅外光譜和高效液相色譜對(duì)其結(jié)構(gòu)和單糖組成進(jìn)行初步分析，分子篩層析法測(cè)定其分子質(zhì)量。結(jié)果表明，F(xiàn)UP－1為均一組分的雜多糖，主要由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量比為5∶1∶1，平均分子質(zhì)量為 4.1 ×104D。體外抗氧化活性分析表明，F(xiàn)UP－1具有較強(qiáng)的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力［25］。2012年，Yang＆ Duan從平貝母中分離出1組新的復(fù)合成分［26］。

3 繁殖方法

平貝母既可進(jìn)行有性繁殖，又可用于進(jìn)行無性繁殖。用種子繁殖生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，收效較慢，一般需6年左右方能收獲，用鱗莖繁殖，2年便可收益，故生產(chǎn)上多采用鱗莖繁殖法［27－28］。利用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行大規(guī)模克隆繁殖，無疑可以減輕對(duì)野生植物的采集壓力，同時(shí)也是獲大量?jī)?yōu)良種苗的途徑之一。目前的組織培養(yǎng)研究著重于優(yōu)化培養(yǎng)條件，如外植體的取材、培養(yǎng)基成分和激素的選擇試驗(yàn)。趙國(guó)凡等用組織培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)平貝母的不同器官，形成了愈傷組織，鱗莖和植株，為促進(jìn)平貝母的繁殖速度創(chuàng)造了條件，經(jīng)過對(duì)愈傷組織的初步測(cè)定，證實(shí)有生物堿反應(yīng)。而當(dāng)年新鱗莖低溫處理(3～7℃)后進(jìn)行的組織培養(yǎng)，使進(jìn)行“二季作”成為可能，同時(shí)也為用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行貝母生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要條件。該試驗(yàn)證實(shí)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)平貝母離體組織的脫分化及其器官再生，具有顯著的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)還表明，愈傷組織雖經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，其分化小鱗莖和小植株的能力仍繼續(xù)保持［29］。唐巍等以平貝母無菌苗幼莖切段誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為試材，研究了基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、繼代時(shí)間及繼代周期時(shí)間對(duì)愈傷組織分化的影響。結(jié)果表明，MS基本培養(yǎng)基有利于不定芽的誘導(dǎo)，MN培養(yǎng)基有利于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。在MN培養(yǎng)墓上，隨著蔗糖濃度的升高，不定芽發(fā)生能力下降，體細(xì)胞胚發(fā)生率升高。繼代時(shí)間越長(zhǎng)，不定芽及體細(xì)胞胚的發(fā)生能力均下降。體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最佳繼代周期時(shí)間是21 d，不定芽發(fā)生的最佳繼代周期時(shí)間是28 d［30］。此前的另一項(xiàng)研顯示，平貝母愈傷組織繼代過程中染色體變異，并認(rèn)為染色體遷移是形成超二倍體和四倍體的原因，部分染色質(zhì)遷移是形成亞二倍體和超二倍體的原因。從再生植株的染色體數(shù)目來看，繼代多次后二暗體細(xì)胞頻率仍占85%以上，說明再生植株在遺傳上的穩(wěn)定性。然而，少數(shù)單倍體及四倍體植株的出現(xiàn)對(duì)平貝母遺傳育種和作物改良有一定參考價(jià)值［31］。2010年，李余先以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素配比進(jìn)行平貝母鱗莖離體培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明:生長(zhǎng)素NAA對(duì)形成愈傷組織有主導(dǎo)作用，添加量以0.6 mg/L，較為合適，6－BA和KT對(duì)促進(jìn)芽分化都能起主導(dǎo)作用，6－BA 以0.4 mg/L為好，KT以1.0 mg/L為好，在生根階段，添加2.0 mg/L 的 IBA 較為理想［32］。

4 傳粉生態(tài)學(xué)

關(guān)于平貝母的傳粉方式等生殖生物學(xué)特性方面較少，任躍英等對(duì)平貝母開花習(xí)性及花粉生命力研究表明，其中以8～12 h開花最多，開花率占全天87.76%，為開花高峰。平貝母柱頭有效期約為8 d，從始花到柱頭進(jìn)入有效期約需3～4 d，因此花開放4 d后為最適授粉期。不同時(shí)期采集的花粉生命力確有差異，并且不論是TTC染色還是基質(zhì)中萌發(fā)得到一致的趨勢(shì)，均表現(xiàn)盛花期的花粉生命力最強(qiáng)［33］。張曉軍等用TTC法測(cè)定花粉的活力，用聯(lián)苯胺－過氧化氫法測(cè)定柱頭的可授性，通過實(shí)地觀測(cè)訪花者、套袋實(shí)驗(yàn)、花粉－胚珠比(P/O比)的估算及花粉粒形態(tài)的觀察研究了平貝母的傳粉特性及繁育系統(tǒng)類型。結(jié)果表明，平貝母的花粉活力在開花后2～5 d可達(dá)90%以上，6 d后有所減弱，10 d后仍有71.3%的花粉保持活力。柱頭的可授期約持續(xù)8 d，在開花后3～4 d柱頭的可授性最強(qiáng)，5 d以后可授性逐漸減弱。平貝母的繁育系統(tǒng)是以自花傳粉為主，蟲媒異花傳粉為輔的兼性自交。研究結(jié)果為平貝母的品種選育、雜交育種、引種栽培及物種保育提供了理論和技術(shù)依據(jù)，為深入研究貝母屬植物的演化提供了生殖生態(tài)學(xué)依據(jù)［34］。

5 分子生物學(xué)

2006年，宋顯偉根據(jù)Copia－like類反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從平貝母基因組中擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度為240bp左右的PCR產(chǎn)物。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和克隆，并隨機(jī)挑選76個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果得到了57個(gè)不同的序列。BlastX分析以及與已鑒定的Copia－like類反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域序列比對(duì)表明這些克隆序列均為真實(shí)的反轉(zhuǎn)錄酶序列。進(jìn)行同源序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些序列可分為11組，且這些核苷酸序列在組內(nèi)和組間均有較大的差異，表明核苷酸序列的高度異質(zhì)性。這57個(gè)序列中，僅有12個(gè)為完整的序列，其余的都有移碼突變，終止子或二者兼有。Southern雜交結(jié)果顯示了各組序列在平貝母基因組中的分布情況。甲基化分析則表明這些序列在平貝母的基因組中均被高度甲基化。該研究認(rèn)為認(rèn)為Copia－like類反轉(zhuǎn)座子在平貝母中以家族的形式廣泛存在，其序列間存在較大的異質(zhì)性，而且，大部分為不完整的序列，表明這類反轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中逐漸沉默成為無功能的假基因［35］。李玉鋒通過對(duì)不同產(chǎn)地的8種貝母RAPD的分析，探討貝母種間的遺傳差異，結(jié)果表明，地理分布距離越小，貝母的遺傳差異越小，反之越大［36］。

6 展望

綜上所述，前人對(duì)平貝母的研究涉獵比較廣泛，但作為國(guó)家三級(jí)瀕危保護(hù)植物，其當(dāng)前野生資源概況并不清楚，保護(hù)生物學(xué)方面的研究始終未見報(bào)道。因此，期待開展相關(guān)研究:(1)野生種質(zhì)資源調(diào)查與保存。雖然平貝母的栽培比較普遍，但由于長(zhǎng)期的亂采爛挖，其野生資源急劇減少，最突出的問題是野生生境的大面積破壞。因此，有必要對(duì)平貝母的種質(zhì)資源進(jìn)行全面調(diào)查，這對(duì)于優(yōu)良品種的選育、穩(wěn)定藥材質(zhì)量和種質(zhì)的可持續(xù)利用具有重要意義。(2)遺傳多樣性研究。由于平貝母零星分布，居群間隔大，導(dǎo)致居群間基因流基本上停滯;生境的破壞以及由此引起的種子適合度下降和繁育系統(tǒng)的變化，居群內(nèi)遺傳多樣性的降低將會(huì)進(jìn)一步加劇其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性下降。較弱的生存能力在受到外界的干擾后，很容易導(dǎo)致物種的滅絕，這也要求我們加快對(duì)平貝母遺傳多樣性的研究。

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