簡(jiǎn)述毛細(xì)管電泳在中藥研究中的應(yīng)用

甘勇強(qiáng) 周 梁 王 靜

廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021

毛細(xì)管電泳 (Capillary Electrophoresis)又稱高效毛細(xì)管電泳 (HPCE)，是指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間濃度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)［1］。HPCE按毛細(xì)管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理的不同主要可分為：毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE);毛細(xì)管等速電泳 (CITP);毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC);毛細(xì)管凝膠電泳 (CGE);毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)［2］。

1 在中藥有效成分測(cè)定中的應(yīng)用

一種中藥材含有多種有效成分，通常多為黃酮類、蒽醌類、生物堿類、有機(jī)酸類、及各種苷類等，這些組分結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類多樣且在藥材中含量不高，用普通的分離方法難以完全分離和定量測(cè)定，而多味藥材組成的復(fù)方的成分測(cè)定，普通的分離方法就更加難以勝任。但是，這些成分都可以用CE進(jìn)行分析。目前，CE已被廣泛用于中藥材及中藥復(fù)方制劑的成分分析。

1.1 黃酮類 黃酮類化合物一般不帶電，方法大都采用MECC模式。也可以利用黃酮類化合物含有鄰羥基，可與硼砂結(jié)合成帶電粒子，再用CZE分離模式。戴忠［3］等人在膽酸鈉系統(tǒng) (10mmol/L硼酸鈉，15 mmol/L磷酸二氫鈉，40 mmol/L膽酸鈉)-乙腈 (3∶2)，pH=7.0的緩沖液中，采用MECC模式測(cè)定卷柏屬植物中3種雙黃酮類化合物—穗仡杉雙黃酮、扁柏雙黃酮和銀杏雙黃酮的含量。Zhang［4］等對(duì)傳統(tǒng)藏藥細(xì)葉小苦荬中的三種黃酮類有效成份：(3R)-7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷、槲皮素和山奈酚在20 mmol/LpH 9.5的硼砂緩沖體系中進(jìn)行了分離分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。黎波濤［5］等以5%甲醇與95%硼砂 (40mmol/L，pH=10.0)溶液為電泳緩沖液，分離電壓16.5kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm為條件下，分離大豆籽中6種大豆異黃酮組分，均可在21min內(nèi)完全分離并具有良好的線性關(guān)系。

1.2 蒽醌類 蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中多有羥基和羧基，用CZE和MECC都能分析。鄭文捷［6］等利用MECC同時(shí)分離測(cè)定中藥大黃及青海野生大黃茶中3種主要活性蒽醌成分含量。方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于大黃藥材和青海野生大黃茶的質(zhì)量控制。李偉［7］等以50cm×75μm i.d.未涂層石英分光毛細(xì)管，分離電壓 20kV，0.05mol/L KH2PO4-Na2HPO4(pH=8.2) 緩沖溶液，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，以氨基苯磺酸為內(nèi)標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)大黃提取液中五種蒽醌化合物含量的同時(shí)分離和測(cè)定。此外，采用CZE與MECC結(jié)合還可成功分離芍藥中本芍藥苷等成分;以CZE分離模式還可分離野菊花中7種香豆索類化合物和分析測(cè)定獨(dú)活中9種香豆素類成分等［8］。

1.3 生物堿類 HPCE具有十分多樣的分離模式，生物堿類成分同其他天然的次生代謝產(chǎn)物一樣一般采用CZE和MECC兩種分離模式。采用MECC法研究9種阿樸啉類生物堿，其分析時(shí)間僅為9min，比HPLC約縮短一半時(shí)間。中藥益母草的有效成分主要為生物堿類，從益母草中提取并鑒定出結(jié)構(gòu)的生物堿有水蘇堿、益母草堿、益母草定等，其中水蘇堿含量較高，王峻梅等用高頻電導(dǎo)毛細(xì)管電泳測(cè)定了益母草中水蘇堿含量，檢出限為 2.5g/L［9］王瑞娜［10］等以CZE對(duì)苦參中的苦參堿、槐定堿及金雀堿進(jìn)行了分離分析，效果較好。

1.4 有機(jī)酸類 李利軍［11］等采用MEKC法分離檢測(cè)胡黃連提取液中三種有機(jī)酸香草酸、肉桂酸和阿魏酸的含量。楊芳［12］等利用HPCE法測(cè)定復(fù)方茵黃解毒湯中的咖啡酸和阿魏酸含量，咖啡酸和阿魏酸的平均回收率均大于95%;RSD均小于3%(n=3)。方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、快速，可用于復(fù)方茵黃解毒湯的質(zhì)量控制。

1.5 皂苷類及苷類 李藝［13］等以磺丁基 -β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)和β-環(huán)糊精 (β-CD組成二元手性選擇體系，用毛細(xì)管電泳法對(duì)柴胡中的柴胡皂苷a及柴胡皂苷d進(jìn)行分離測(cè)定?？疾炝司彌_液的組成和濃度、手性選擇劑的組成和濃度、進(jìn)樣方式及樣品介質(zhì)等對(duì)靈敏度和分離度的影響。黃寶美［14］等使用自行設(shè)計(jì)的毛細(xì)管電泳柱端安培檢測(cè)系統(tǒng)，采用非水介質(zhì)毛細(xì)管電泳法對(duì)野菊花中蒙花苷的含量進(jìn)行測(cè)定?？疾炝司彌_溶液濃度及其pH值、非水介質(zhì)的濃度、檢測(cè)電位對(duì)測(cè)定的影響。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，蒙花苷的質(zhì)量濃度在2.0～80 mg/L范圍內(nèi)與峰高呈良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)為0.9996，檢出限為0.20 mg/L，平均加標(biāo)回收率為99%。

1.6 酚類 祁靜［15］等建立了同時(shí)測(cè)定檳榔殼中6種酚類物質(zhì)的高效毛細(xì)管電泳方法，該方法簡(jiǎn)便快速，能在20 min之內(nèi)將l0種酚類物質(zhì)完全分離開(kāi)，具有良好的精密度、回收率和線性關(guān)系 檢測(cè)限范圍為0.5875～4.4152 μg/ml。

1.7 中藥復(fù)方制劑的成分分析 中藥復(fù)方制劑由多種藥材組成，成分復(fù)雜。目前控制其質(zhì)量的方法是測(cè)定其中一種或多種主要活性成分的含量。而用常規(guī)HPLC方法分析，中藥中一些成分如糖類、生物堿類等容易在色譜柱上吸附，造成分析物的分離困難和色譜柱的損壞。而CE具有高效、快速、柱子便宜且易于清洗等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的成分分析。如孫國(guó)祥［16］等采用CZE法建立了逍遙丸的毛細(xì)管電泳指紋圖譜 (CEFP)，確定13批逍遙丸樣品的21個(gè)共有指紋峰，具有較好的精密度和重現(xiàn)性。陳亞飛［17］等建立了復(fù)方石韋片中槐果堿和苦參堿的分離測(cè)定方法。其中槐果堿和苦參堿的線性范圍分別為0.5～5.76μ g/ml和0.66～13.2μg/ml，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9991 和 0.9993，平均回收率分別為99.5%和99.3%，RSD分別小于4% 和2%(n=3)。

2 在中藥指紋圖譜建立中的應(yīng)用

中草藥指紋圖譜系指中藥材經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該藥材特性的共有峰的圖譜。它不要求呈現(xiàn)在圖譜中的每一個(gè)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)都清楚，也不要求每一個(gè)組分都精確定量，但要求圖譜信息盡可能清晰、豐富，并具備“指紋”特征［18］。中藥指紋圖譜是國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量最有效的方法之一，也是我國(guó)中藥走向現(xiàn)代化的一個(gè)重要內(nèi)容。趙軍［19］對(duì)7種不同產(chǎn)地的土木香進(jìn)行了分析，初步建立了以7個(gè)共有峰為特征指紋信息的I-IPCE指紋圖譜。臧鵬［20］等應(yīng)用毛細(xì)管電泳法建立六味地黃丸的指紋圖譜，該法建立的六味地黃丸指紋圖譜共有15個(gè)共有峰，且各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均在3%以內(nèi)，其相對(duì)峰面積的波動(dòng)范圍均滿足要求，能夠控制其質(zhì)量。另外采用CE與其他進(jìn)樣技術(shù)如流動(dòng)注射聯(lián)用、CE-NMR、CE-MS-MS、HPLC-CE-MS、CE-AES、CE-AFS、CE-ICP-MS以及不同電泳技術(shù)之間的聯(lián)用，充分利用CE的高分離效率和MS或NMR的高靈敏度與定性鑒定性，能快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，聯(lián)用技術(shù)不僅可建立中藥或復(fù)方藥物指紋圖譜，還可進(jìn)行多種有效成分或指標(biāo)成分定量。

3 在中藥藥理及藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，中藥有效成分的藥代動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)得到極大的關(guān)注，通過(guò)對(duì)中藥藥代、藥理的研究可以更科學(xué)系統(tǒng)地闡明中藥組方的原理，為研究古方，篩選處方，開(kāi)發(fā)新藥提供科學(xué)的依據(jù)和方法。目前CE已應(yīng)用于中藥有效成分藥代、藥理的研究，闡明其藥物代謝的機(jī)理和產(chǎn)物，探討其藥效、作用機(jī)制、方劑組成和配伍規(guī)律等［21］。楊燕［22］等建立了丹參中丹參素在家兔血漿中的MEKC分析方法，并研究了其藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布。田景振［23］等利用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定兩種自制葛根黃酮緩釋膠囊中主要有效成分葛根素在家兔體內(nèi)的藥一時(shí)曲線，測(cè)算其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。檢測(cè)其緩沖效果，以愈風(fēng)寧心片作參比制劑，結(jié)果愈風(fēng)寧心片及樣品制劑在家兔體內(nèi)均符合二室開(kāi)放模型，葛根黃酮緩釋膠囊呈現(xiàn)一定的緩釋效果。

4 在中藥鑒定中的應(yīng)用

李玉琪等［24］利用HPCE法以赤土茯苓苷為土茯苓的標(biāo)志性成分，選擇了MEKC分離模式對(duì)土茯苓 (百合科菝莫屬植物光葉菝葜的干燥莖)及其6種混用品進(jìn)行了鑒別。

炮制對(duì)中藥材的影響重大，是目前中藥研究的熱點(diǎn)之一。曾振興等［25］采用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定龍膽草炮制前后龍膽苦苷的含量變化，為龍膽草炮制條件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)炮制后龍膽草中龍膽苦苷的含量出現(xiàn)不同程度降低。高言明等［26］采用毛細(xì)管電泳法考察黃連、黃柏藥材炮制前后小檗堿的含量變化，發(fā)現(xiàn)炮制后小檗堿的含量均有降低，且該法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

5 在中藥材農(nóng)藥檢測(cè)分析中應(yīng)用

我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，使用農(nóng)藥防治病蟲(chóng)害是一項(xiàng)重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)措施，但隨著農(nóng)藥品種和施用量的不斷增加，農(nóng)藥殘留問(wèn)題日益突出。因此建立快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法以控制農(nóng)藥殘留的發(fā)生已成為重中之重。近年來(lái)毛細(xì)管電泳逐漸用于農(nóng)藥殘留的分離分析，并顯示出極大的潛力。趙燕燕等［27］采用MEKC測(cè)定麻黃中的啶蟲(chóng)瞇和吡蟲(chóng)啉的農(nóng)藥殘留，檢出限分別為0.04和0.08 mg/L，回收率＞89%，RSD＜5%。趙燕燕等［28］又比較了該方法和氣相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)，研究表明，MEKC在線推掃富集技術(shù)樣品的前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣，但檢測(cè)限不如氣相色譜低，2種方法的精密度、回收率和樣品測(cè)定結(jié)果均無(wú)顯著差異。Carabias-Mart í nez等［29］建立了馬鈴薯中三嗪除莠劑的非水凝膠毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，樣品經(jīng)加壓液體萃取、固相萃取小柱凈化后上機(jī)檢測(cè)，得到檢出限為10μ g/kg～15μg/kg，該方法同樣可應(yīng)用于其他塊莖類中藥、蔬菜和糧食的檢測(cè)。

6 在物化參數(shù)測(cè)定及手性拆分中的應(yīng)用

毛細(xì)管電泳作為傳統(tǒng)方法的重要補(bǔ)充應(yīng)用于理化參數(shù)的測(cè)定，與傳統(tǒng)的測(cè)定方法相比，簡(jiǎn)化了操作步驟，并且所需樣品量少，對(duì)樣品的純度要求不高，有多種模式可供選擇，測(cè)定速度快，準(zhǔn)確性好，因而在理化參數(shù)的測(cè)定方法得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［30］。黃端華［31］等采用毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法對(duì)瑞香苷進(jìn)行了水解動(dòng)力學(xué)研究。瑞香素是瑞香苷的水解產(chǎn)物，考察了瑞香苷 (DN)和瑞香素 (DP)的紫外吸收隨水解反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)行而發(fā)生的變化，計(jì)算得水解的速率常數(shù)，并總結(jié)了酸度和溫度對(duì)速率常數(shù)的影響規(guī)律。同時(shí)，根據(jù)阿侖尼烏斯公式計(jì)算該反應(yīng)的活化能為91.62 kJ/mol.此法用于測(cè)定瑞香苷水解常數(shù)簡(jiǎn)便、直觀關(guān)。

CE不僅在物化參數(shù)的測(cè)定方面得到運(yùn)用，在幾年來(lái)較為熱門的手性拆分方面也得到快速的發(fā)展。例如周潔宇［32］等通過(guò)考察電泳緩沖液pH、環(huán)糊精種類和濃度、有機(jī)溶劑濃度及操作電壓和溫度對(duì)分離的影響，建立了以12mmol/L的羥丙基-β-環(huán)糊精為手性選擇劑，200mmol/L的硼酸/甲醇 (V：V=7：3，pH 9.7)為電泳緩沖溶液，23kV的分離電壓，在30℃下可使橙皮苷對(duì)映體達(dá)到基線分離，分離度為1.50的簡(jiǎn)便快捷的高效毛細(xì)管電泳拆分橙皮苷對(duì)映體的方法。

7 結(jié)語(yǔ)

CE是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，在中藥研究領(lǐng)域中充分展示了其優(yōu)越性，有廣闊的應(yīng)用前景。隨著中藥研究的深入，CE法因其特有的優(yōu)點(diǎn)將被更為廣泛地應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域。例如一些傳統(tǒng)用藥的有效成分是一些短肽(如傳統(tǒng)中藥全蝎的主要成分為蝎毒蛋白)，這利用傳統(tǒng)技術(shù)是很難進(jìn)行檢測(cè)的，而CE不僅用來(lái)分離和檢測(cè)一些小分子的有機(jī)化合物，還可以用來(lái)檢測(cè)微量元素、多肽、蛋白、細(xì)胞等物質(zhì)，因此可以嘗試用CE法對(duì)其進(jìn)行定性甚至定量分析。綜上所述，CE在中藥研究中的應(yīng)用將越來(lái)越廣。隨著商品儀器經(jīng)不斷改進(jìn)和完善，加上自動(dòng)進(jìn)樣器的普遍使用，基本可以克服重現(xiàn)性差的缺陷，與常規(guī)HPLC法接近;而其靈敏度低可通過(guò)在線富集技術(shù)如樣品堆積法、等速電泳法、掃集法(Sweeping)、離子選擇性耗盡掃集法、pH調(diào)制法，或經(jīng)濃縮預(yù)處理如固相萃取等技術(shù)加以改善［21］?？傊?，CE作為一種高效、便捷的分離技術(shù)，在中藥研究領(lǐng)域中將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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