萊克多巴胺的檢測(cè)方法及注意事項(xiàng)

時(shí)冉冉 姜 波 王 濤

（1.山東省濟(jì)南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心 山東濟(jì)南 250000；2.山東省濟(jì)南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心 山東濟(jì)南 250000；3.山東省濟(jì)南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟(jì)南 250002）

萊克多巴胺屬于β-興奮劑，可行使?fàn)I養(yǎng)重新分配，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類(lèi)衍生物，它可以加快畜禽生長(zhǎng)速度，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率。在歐盟β-興奮劑已被禁止用于家禽的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，我國(guó)在《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》中也有明文規(guī)定，但由于萊克多巴胺屬于非處方藥，且價(jià)格遠(yuǎn)低于克倫特羅，因此，其非法應(yīng)用者不斷增多。

酶聯(lián)免疫吸附法是目前β-興奮劑類(lèi)最佳的檢測(cè)方法。ELISA檢測(cè)方法有雙抗體夾心法測(cè)抗原、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體等。利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)瘦肉精，具有速度快，靈敏度高的特點(diǎn)，是保證肉品衛(wèi)生安全的較好監(jiān)控方法，對(duì)以后瘦肉精檢測(cè)工作的發(fā)展具有指導(dǎo)作用。

1 試驗(yàn)原理

其原理是利用多克隆抗體既能與萊克多巴胺結(jié)合，也能與包被抗原結(jié)合。這些包被抗原被固定在酶標(biāo)板孔壁上，當(dāng)樣品中含有萊克多巴胺時(shí)，它與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體中有限量的結(jié)合位點(diǎn)。由于每一個(gè)孔中抗體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相同，當(dāng)樣品中萊克多巴胺濃度低時(shí)，就有更多抗體的位點(diǎn)與包被抗原結(jié)合，更多的抗體被固定在酶標(biāo)板壁上，就會(huì)與更多的酶標(biāo)二抗結(jié)合，所以結(jié)果就呈現(xiàn)深藍(lán)色。相反，樣品的萊克多巴胺濃度高，結(jié)果就呈現(xiàn)淺藍(lán)色。加入終止液后，藍(lán)色相應(yīng)變成黃色，然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。這種方法可定性、定量檢測(cè)尿液、飼料、組織樣本中萊克多巴胺的殘留量。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 試劑和材料

萊克多巴胺-酶聯(lián)免疫試劑盒，去離子水，豬肉樣本。

2.2 儀器

酶標(biāo)儀、天平、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、離心機(jī)、振蕩器、微量移液器等。

2.3 樣品前處理步驟

抽取具有一定批量的有代表性的無(wú)皮豬肉，剔除雜質(zhì)、脂肪。將精肉用均質(zhì)器均質(zhì)樣本至均勻，放置冰箱冷凍備用。取均質(zhì)的樣品2.0g±0.05 g加入50 ml聚苯乙烯離心管中，加入8 ml提取工作液，用振蕩器充分震蕩10 min，用離心機(jī)3 000 r/min 以上離心10 min。取20 μl上層清夜用于分析。如果上層有白色脂肪層，取樣時(shí)應(yīng)避開(kāi)。

2.4 試驗(yàn)步驟與結(jié)果計(jì)算

2.4.1 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、酶標(biāo)二抗和抗體工作液 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品到對(duì)應(yīng)的微孔中，每孔20 μl，隨即每孔加入酶標(biāo)二抗50 μl，再加入抗體工作液80 μl/孔，注意加入抗體時(shí)不要讓槍頭沾染孔里的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕震蕩混勻，于25℃避光環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)45 min。

2.4.2 洗板 每孔加入250 μl 洗液，放置1 min，再甩掉洗滌液，重復(fù)3 次，每次間隔10 s，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上拍干。

2.4.3 顯色 每個(gè)孔中加入底物液A液50 μl，再加入底物液B液50 μl，輕輕震蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min。

2.4.4 測(cè)定 顯色后每孔加入50μl 的終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)樣和各樣品450 nm 處的光密度（OD）值。

2.5 結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中萊克多巴胺的實(shí)際濃度。若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

3 注意事項(xiàng)

3.1 樣本和試劑盒的貯存

均質(zhì)好的肉類(lèi)樣本應(yīng)冷凍于冰箱里，試驗(yàn)前回溫。試劑盒在4℃貯存并且避光，抗體和酶標(biāo)二抗（IGg-HRP）在常溫下容易變性，須冷藏保存，使用時(shí)直接拿出按比例稀釋。試驗(yàn)中試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20℃～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

3.2 樣品處理步驟

實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。加樣時(shí)應(yīng)將所加物用微量加樣器加在ELISA板孔的底部，可用左手扶住微量加樣器的中部，避免加在孔壁上部，并防止濺出和產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。

3.3 恒溫孵育

在實(shí)驗(yàn)中有兩次抗原抗體反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育或孵育。因?yàn)镋LISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。一般最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化，并且所有的恒溫孵育過(guò)程中要避免光線照射。在加入底物液A和B以后，一般顯色15 min即可，若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20 min（或更長(zhǎng)），但不得超過(guò)25 min，反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

3.4 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)，ELISA 就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。如果洗板被污染或洗滌用水被游離的酶標(biāo)記物污染、洗滌次數(shù)不夠或注水量不足、洗板后間隔時(shí)間太久致使板孔干燥等都會(huì)直接影響檢測(cè)的最終結(jié)果，嚴(yán)重者實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生顏色致使實(shí)驗(yàn)失敗。

3.5 顯色

顯色是ELISA 中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。酸性終止液硫酸會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450 nm）測(cè)讀吸光值。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96 孔的座架中，才可進(jìn)行比色。并在加底物液顯色前將軟板邊緣剪凈，以使軟板完全平妥坐入座架中，然后依次測(cè)量不同濃度下的OD 值。